吳 超，高貴珍，單玲玲，李紅俠

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

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SP對(duì)帕金森小鼠脾臟結(jié)構(gòu)及抗氧化功能的影響

吳 超，高貴珍*，單玲玲，李紅俠

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

[目的]探討硫酸化茯苓多糖(SP)對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森小鼠脾臟結(jié)構(gòu)和抗氧化功能的影響。[方法]將ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MPTP組和治療組(三組)，實(shí)施腹腔注射給藥，處死取小鼠脾臟，HE染色觀察各組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的變化，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)小鼠脾臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性、抗超氧陰離子活力及丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)含量。[結(jié)果]MPTP組小鼠脾臟紅髓比例升高，充血明顯，脾臟組織抗氧化酶活性、抗超氧陰離子的活力明顯下降，MDA、H2O2含量升高。治療組中小鼠脾臟淋巴小結(jié)體積增大，充血現(xiàn)象減輕，脾臟中各種抗氧化酶活性及抗超氧陰離子的活力均有不同程度的增強(qiáng)，MDA、H2O2含量降低。[結(jié)論]SP可以緩解帕金森小鼠脾臟損傷，提高脾臟抗氧化能力。

SP；MPTP；抗氧化；HE染色

帕金森病(PD)又被稱為震顫麻痹，是一類主要發(fā)生在中老年齡階段的慢性疾病，隨年齡增長(zhǎng)，發(fā)病率具有增加的趨勢(shì)。PD是一種慢性運(yùn)動(dòng)障礙性病癥，患者臨床病狀有靜止性震顫、局部或全身性肢體不受控制、姿勢(shì)平衡障礙等，嚴(yán)重者會(huì)伴有記憶功能衰退、行動(dòng)遲緩和肢體僵直[1-3]。其主要病因是中腦中黑質(zhì)和紋狀體的病理性病變，腦內(nèi)多巴胺分泌量減少，從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。脾臟是所有脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的最主要的淋巴器官，能通過(guò)多種調(diào)節(jié)機(jī)制起到吞噬異物、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的保護(hù)作用。中醫(yī)學(xué)將帕金森病歸于虛損的范疇，以肝腎脾陰虛的病機(jī)去認(rèn)識(shí)PD，認(rèn)為脾臟是后天之本，脾虛則氣血虧乏，四肢容易出現(xiàn)顫震[2]，故脾陰虛是PD的病機(jī)關(guān)鍵，脾虛在PD病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。目前帕金森病治療藥物左旋多巴胺等都有一定的毒副作用，長(zhǎng)期服用甚至?xí)鹕窠?jīng)系統(tǒng)功能障礙。相關(guān)臨床醫(yī)學(xué)表明[4-6]，通過(guò)健脾益氣、養(yǎng)脾陰法等方法能在一定程度上緩減帕金森的癥狀，減輕西藥的毒副作用，因此，開(kāi)發(fā)中藥預(yù)防治療帕金森病有重要的意義。

藥用茯苓是一種具有抗氧化、抗腫瘤的免疫活性調(diào)節(jié)作用的菌核，有健脾的獨(dú)特功效，而茯苓多糖也是目前研究較為廣泛的天然多糖之一，硫酸化茯苓多糖(SP)是單糖分子上的某些羥基被硫酸根所取代的一類多糖衍生物，有研究表明它在抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面都有良好的臨床治療效果[7-8]。本文作者前期已開(kāi)展了SP急性毒性試驗(yàn)、體內(nèi)代謝及其對(duì)慢性腎功能衰竭的防治作用等方面研究，但有關(guān)SP對(duì)帕金森小鼠脾臟結(jié)構(gòu)和抗氧化功能的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)是一種神經(jīng)毒素，其本身并沒(méi)有毒性，僅僅是一種能通血腦屏障的普通脂溶性有機(jī)化合物。但是，當(dāng)MPTP進(jìn)入大腦之后，會(huì)被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的單胺氧化酶B代謝成有毒的陽(yáng)離子MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)。MPP+不僅能殺死黑質(zhì)致密部產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元，還能干擾線粒體代謝中相關(guān)酶的功能。MPTP可產(chǎn)生類似于帕金森癥的病理學(xué)病癥，是成熟穩(wěn)定的帕金森建模誘導(dǎo)劑[7]。本文以MPTP誘導(dǎo)ICR小鼠建立帕金森氧化模型，通過(guò)觀察小鼠脾臟的病理特征變化和檢測(cè)小鼠脾臟中GSH-Px、CAT、SOD、抗超氧化物陰離子活力以及MDA、H2O2的含量，探討SP對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森小鼠脾臟結(jié)構(gòu)和抗氧化功能的影響，揭示其潛在的帕金森治療效應(yīng)，為神經(jīng)保護(hù)藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

掃描酶標(biāo)儀(Sunrise奧地利TECAN)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUSIX71，日本奧林巴斯)，切片機(jī)，超低溫冰箱(DW-HW138，中科美菱)，冷凍研磨機(jī)(Cryomill，德國(guó)萊馳)，冷凍離心機(jī)(Neofuge23R/TGL-16G，香港力康/上海安亭)。

MPTP來(lái)自于Sigma公司，硫酸化茯苓多糖由合肥學(xué)院饋贈(zèng)，蘇木精染色液、伊紅染色液、95%和無(wú)水乙醇、濃鹽酸、0.01mol/LPBS、二甲苯。SOD、GSH-Px、CAT、MDA、H2O2以及超氧陰離子活力活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥

40只雄性ICR小鼠，體重控制在25～30g范圍內(nèi)，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)。

表1 動(dòng)物分組及給藥方案

1.2.2 處死與勻漿

停藥后在第18天用引頸處死法處死各組小鼠，取小鼠脾臟，剪碎組織，按重量體積比1∶9加入0.9% 生理鹽水，置于冷凍研磨機(jī)中粉碎離心，轉(zhuǎn)速設(shè)置為2 500～3 000r/min，離心10min，取勻漿上清備用。

1.2.3 小鼠脾臟的冷凍切片及HE染色

取各組小鼠脾臟組織，4%多聚甲醛PBS固定，石蠟包埋，冷凍切片機(jī)切出5μm完整橫切面切片，按HE染色流程染色。

圖1 脾臟石蠟切片HE染色步驟

1.2.4 氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

分別測(cè)定各組小鼠脾臟GSH-Px、CAT、SOD活性、抗超氧陰離子的活力以及MDA及過(guò)氧化氫的含量，按試劑盒方法進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)公式計(jì)算各指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用One-wayANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性分析比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異顯著，P<0.001為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1SP對(duì)小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的影響

由脾臟病理照片可知：對(duì)照組紅髓和白髓界限清晰并且易于觀察，二者比例屬于正常，淋巴小結(jié)體積比較大，其中淋巴細(xì)胞較為稠密。MPTP模型組紅髓和白髓界限不明顯，紅髓比例增高，脾血竇擴(kuò)張，充血比較明顯，說(shuō)明模型組動(dòng)物脾臟受到損傷。與MPTP模型組相比，SP治療組均能顯著增大淋巴小結(jié)體積，經(jīng)SP治療后，紅、白髓界限比較清晰，充血現(xiàn)象有所減輕，說(shuō)明SP在一定程度上能緩解脾臟的損傷。

圖2 SP對(duì)小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的影響(×100)

圖3 SP對(duì)小鼠脾臟SOD酶活力的影響

2.2SP對(duì)小鼠脾臟SOD活性的影響

與對(duì)照組(46.22±5.10)相比，MPTP組(22.96±9.94)SOD酶活性降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MPTP組相比，SP低、中、高濃度治療組(33.34±4.38、44.34±7.44、33.52±10.38)SOD酶活性增大，其中SP為100mg/kg時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明一定濃度的SP可以提高脾臟SOD活性，增強(qiáng)脾臟的抗氧化能力，但高濃度的SP具有一定的毒性。

2.3SP對(duì)小鼠脾臟GSH-PX活性的影響

圖4是SP對(duì)小鼠脾臟GSH-PX酶活力的影響，從圖可見(jiàn)，與對(duì)照組(472.01±37.84)相比，MPTP組(332.41±56.81)小鼠脾臟GSH-PX活性降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)施50～150mg/kg梯度濃度SP治療后，脾臟組織中的GSH-PX活性(444.58±7.70、492.26±41.33、385.16±7.23)都有所提高，其中50、100mg/kg時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 SP對(duì)小鼠脾臟GSH-PX酶活力的影響

2.4SP對(duì)小鼠脾臟CAT活性的影響

圖5 SP對(duì)小鼠脾臟CAT活性

圖5是SP對(duì)小鼠脾臟CAT酶活力的影響，從圖可見(jiàn)，與對(duì)照組(49.28±6.62)相比，MPTP組小鼠脾臟中的CAT酶活性降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與MPTP組相比，SP濃度在100mg/kg以下時(shí)，CAT酶活性(51.05±8.90、45.42±2.17)有提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SP對(duì)CAT酶活性影響明顯，且50mg/kg差異最明顯(P<0.01)，但隨著SP濃度的增加，CAT酶的活性卻有明顯的下降趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明高濃度的SP具有一定毒性。

2.5SP對(duì)小鼠脾臟抗超氧陰離子活性的影響

按照抗超氧陰離子活力單位計(jì)算公式，測(cè)定對(duì)照組、MPTP組、SP治療組抗超氧陰離子活性，由圖可見(jiàn)，與對(duì)照組(1.53±0.13)相比，MPTP組(0.387±0.11)抗超氧陰離子活性極顯著降低(P<0.001)，SP三個(gè)治療組(0.814±0.21、1.085±0.28、0.742±0.16)的抗超氧陰離子活性都有明顯提高(P<0.05)，100mg/kg時(shí)差異顯著(P<0.01)，但隨著濃度的升高，呈下降趨勢(shì),高濃度SP有一定毒性。

圖6 SP對(duì)小鼠脾臟抗超氧陰離子活力影響

2.6SP對(duì)小鼠脾臟MDA含量的影響

圖7 SP對(duì)小鼠脾臟MDA含量的影響

圖7為SP對(duì)小鼠脾臟MDA含量的影響，與對(duì)照組(0.083±0.015)相比，模型組(0.252±0.058)MDA含量顯著提高(P<0.001)，與模型組相比，當(dāng)SP濃度在50～100mg/kg時(shí)，MDA含量(0.085±0.016，0.068±0.019)顯著降低(P<0.001)，當(dāng)SP濃度在150mg/kg時(shí)，MDA含量(0.135±0.026)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與低、中濃度相比，MDA含量升高，說(shuō)明高濃度SP有一定毒性。

2.7SP對(duì)MPTP誘導(dǎo)小鼠脾臟H2O2含量的影響

圖7為SP對(duì)小鼠脾臟H2O2含量的影響，與對(duì)照組(107±15)相比，模型組(132±32)H2O2含量有提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比，SP治療組H2O2含量(112±26，97.4±19，96.2±17)有所降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著SP濃度的增加，H2O2含量稍有降低，但差別不明顯。

圖8 SP對(duì)小鼠脾臟過(guò)氧化氫含量的影響注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與MPTP組相比，*P<0.05。

3 討論

帕金森病是一種進(jìn)展緩慢的慢性退行性病變，從中醫(yī)角度看，久病人絡(luò)，久病多痊，血流滯緩，瘀血阻絡(luò)是帕金森病的重要病機(jī)。脾為后天之本，氣血生化之源，五臟之中心，健脾可益氣養(yǎng)血、化痰通絡(luò)、潛陽(yáng)熄風(fēng)[2]。馬云枝等人據(jù)此研制的熄風(fēng)定顫丸，治療帕金森病具有明顯的療效；與西藥美多巴等配合應(yīng)用，具有減毒增效的作用[2]。茯苓多糖不但具有抗氧化、抗腫瘤的免疫活性，而且有著健脾的獨(dú)特功效，因此從脾臟結(jié)構(gòu)和抗氧化功能入手來(lái)研究硫酸化茯苓多糖對(duì)帕金森病是否有治療效果具有科學(xué)依據(jù)。運(yùn)用中醫(yī)中藥治療帕金森病，長(zhǎng)期以來(lái)在我國(guó)國(guó)民保健體系中起著舉足輕重的作用，也是我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)的一大特色。

研究表明，氧化應(yīng)激釋放大量活性氧自由基(ROS)、相關(guān)蛋白的異常表達(dá)和聚集等都有可能是PD病的發(fā)病基礎(chǔ)。ROS對(duì)細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，可破壞生物膜結(jié)構(gòu)，從而影響正常的細(xì)胞功能，并可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本文中檢測(cè)了抗氧化酶體系中的GSH-Px、SOD和CAT的活性，這些指標(biāo)在機(jī)體清除ROS的過(guò)程起著重要的作用，在一定程度上反映了細(xì)胞的活性狀態(tài)。此外，超氧陰離子自由基、MDA和過(guò)氧化氫等相關(guān)指標(biāo)水平可以反映出細(xì)胞的受損程度。通過(guò)檢測(cè)上述指標(biāo)可以有效地反應(yīng)脾臟組織的活力狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP組小鼠脾臟紅髓比例升高，充血明顯，脾臟組織抗氧化酶(GSH-Px、SOD、CAT)活性、抗超氧陰離子的活力明顯下降，MDA、H2O2含量升高，表明帕金森小鼠建模成功。50、100、150mg/kgSP治療后，小鼠脾臟淋巴小結(jié)體積增大，充血現(xiàn)象減輕，脾臟中各種抗氧化酶活性和抗超氧陰離子的活力均有不同程度的增強(qiáng)，而MDA、H2O2含量降低。在SP三個(gè)濃度組中，100mg/kg治療效果比較明顯，100～150mg/kg的效果無(wú)顯著差異，且多個(gè)檢測(cè)參數(shù)在SP為150mg/kg時(shí)有下降趨勢(shì)，綜上所述，SP在50～100mg/kg時(shí)對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森小鼠脾臟有保護(hù)作用，但較高濃度SP有一定的毒害作用。筆者認(rèn)為，SP可以緩解帕金森小鼠脾臟損傷，提高脾臟抗氧化功能。本文研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

2015-10-09

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013A242、KJ2014A249)；安徽省自然基金面上項(xiàng)目(1308085MG136)；宿州學(xué)院博士啟動(dòng)基金(2014jb05 )宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所開(kāi)放平臺(tái)項(xiàng)目“藍(lán)莓花色素苷的提取及抗癌活性的研究”(2014KYF31)。

吳超(1985-)，安徽無(wú)為人，博士，講師，主要研究方向：動(dòng)物免疫。

R285

：A

：1673-2006(2015)12-0111-04

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.12.030