劉　何，辛　艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

植物SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

劉何，辛艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

目前，植物基因組學(xué)研究中SSR標(biāo)記的應(yīng)用較為活躍。該種標(biāo)記具有近于均勻覆蓋基因組、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，在植物高密度遺傳圖譜繪制、DNA指紋圖譜構(gòu)建、種系純度與親緣關(guān)系鑒定以及植物遺傳進(jìn)化方面具有公認(rèn)的優(yōu)越性。不足之處在于位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記的建立先要根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計，所以引物的高開發(fā)成本一直是非商業(yè)化物種SSR標(biāo)記遺傳研究的主要障礙，而且很多根據(jù)檢索得到的引物的多態(tài)性效果不佳，因此尋找一種快速廉價的引物篩選方法已成為SSR應(yīng)用的熱點(diǎn)問題。這幾年開發(fā)出了多種基于SSR標(biāo)記的方法，如ISSR、SAMPL等。

簡單序列重復(fù)；微衛(wèi)星；DNA標(biāo)記；植物育種

植物相關(guān)的簡單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeats， SSR）標(biāo)記技術(shù)已用于小麥、水稻、大豆等主要大田作物和油菜、甘藍(lán)、黃瓜等多種園藝植物的基因組學(xué)研究［1-2］，該技術(shù)在植物高密度遺傳圖譜繪制、目的基因定位、指紋圖譜構(gòu)建、種系純度檢驗(yàn)及植物遺傳進(jìn)化研究等方面有公認(rèn)的優(yōu)越性［3-5］。

1　DNA分子標(biāo)記

分子水平的遺傳標(biāo)記是以DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子多態(tài)性（指序列、結(jié)構(gòu)等特征存在多種形式）為基礎(chǔ)的標(biāo)記。而DNA標(biāo)記是因DNA發(fā)生缺失、插入、易位、倒位或由于存在長短與排列不一的重復(fù)序列等機(jī)制而產(chǎn)生的多態(tài)性標(biāo)記。具有可遺傳、可識別性，可以是某個結(jié)構(gòu)基因的一部分或是DNA非編碼區(qū)序列［1］，亦或是經(jīng)限制性酶切處理產(chǎn)生的多態(tài)性DNA酶切片斷形式。

DNA分子標(biāo)記較其他標(biāo)記形式的優(yōu)點(diǎn)是：（1）基于DNA水平檢測，能揭示物種本質(zhì)而不受個體發(fā)育水平和環(huán)境條件干擾；（2）數(shù)量眾多，遍布于整個基因組，編碼區(qū)與非編碼區(qū)序列都可作為標(biāo)記，另外，DNA標(biāo)記利用基因組變異檢測的結(jié)果具有較高多態(tài)性，克服了單純利用基因標(biāo)記的缺點(diǎn)，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）都基于DNA的點(diǎn)突變檢測［6-7］，SSR標(biāo)記能檢測到較高的單基因座位多態(tài)性［8］；（3）許多標(biāo)記表現(xiàn)共顯性遺傳，可區(qū)分個體的純合性與雜和性［1］。

2　SSR標(biāo)記技術(shù)

2.1SSR的構(gòu)成

SSR的發(fā)現(xiàn)最初始于動物基因組［4］。之后，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有真核基因組中都存在重復(fù)序列（現(xiàn)在細(xì)菌DNA中也有發(fā)現(xiàn)［9］，也稱衛(wèi)星DNA［10］，DNA復(fù)性動力學(xué)進(jìn)一步證明這類序列往往由大的重復(fù)單位嵌套若干小的乃至更小的串聯(lián)重復(fù)單位構(gòu)成。依據(jù)這些單位的重復(fù)程度，進(jìn)一步分為輕度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列和高度重復(fù)序列［11］。

高度重復(fù)序列是簡單重復(fù)單元的高度重復(fù)形式，重復(fù)序列的單位長度可以為1～6個核苷酸［1，9］，重復(fù)次數(shù)可從幾百次到幾百萬次拷貝數(shù)，所以也稱為微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）［11］或短的串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandemly Repeats，STRs）［12］。已知微衛(wèi)星序列的重復(fù)形式多樣，在基因組中近于均勻分布，其分布情況與基因組大小有關(guān)［9］，果蠅染色體著絲點(diǎn)附近的微衛(wèi)星有ACAAACT、ATAAACT、ACAAAATT等形式，拷貝數(shù)分別達(dá)1.1×107，3.6×107，3.6×107［11］。Skinner等在寄居蟹基因組中發(fā)現(xiàn)一種微衛(wèi)星形式為（TAGG）n［12］。植物中通過對擬南芥、小麥、水稻等研究，證明SSR在基因組中含量很豐富，已發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星有（CA）n，（AT）n，（GC）n，（GATA）n，等等，其重復(fù)次數(shù)多在10～60之間［6］。最常見的為雙核苷酸重復(fù)（GA）n，（AC）n是小麥和水稻中最普遍的雙核苷酸重復(fù)形式。小麥中（AC）n拷貝數(shù)達(dá)3 000，（GA）n重復(fù)次數(shù)在6 000以上；水稻中（AC）n與（GA）n重復(fù)次數(shù)分別達(dá)1 000 和2 000以上。栽培型花生中常見的是（GA）n微衛(wèi)星［13］。植物中存在的三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)單位常見的有（AAG）n、（AAT）n，雙子葉與單子葉植物的微衛(wèi)星數(shù)量、分布都是不同的。植物葉綠體中也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星的存在［6］。Toth等已對大量微衛(wèi)星類型及分布情況作了較細(xì)致的總結(jié)［9］。

由于SSR重復(fù)單位的差異，人們把微衛(wèi)星分為核心區(qū)（Core Sequences）與兩側(cè)的側(cè)翼序列。核心區(qū)由短的重復(fù)單位組成，每個單位的堿基數(shù)目一般不變。重復(fù)次數(shù)是高度變異的，不同個體可能差別很大，所以又稱為串聯(lián)重復(fù)數(shù)目變異（VNTR）多態(tài)性。通過評估VNTR的差異可實(shí)現(xiàn)對個體的識別［14］。根據(jù)重復(fù)單位的排列方式，Weber等將核心區(qū)分為完全型（Perfect）、不完全型（Imperfect）和復(fù)合型（Compound）。完全型微衛(wèi)星是由不中斷的重復(fù)單位構(gòu)成的；不完全型其重復(fù)序列中間有3個以下的非重復(fù)堿基，兩側(cè)不中斷的部分重復(fù)數(shù)大于3；復(fù)合型指兩類或兩類以上的串聯(lián)重復(fù)單位由3個連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，但不中斷的重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)不小于5［4］。核心區(qū)兩側(cè)為側(cè)翼區(qū)，其突變少，一般是單拷貝的結(jié)構(gòu)基因區(qū)。Toth等［9］報道真核基因組中位于內(nèi)元（ntron）、基因間隔區(qū)（Intergenic Region）等非編碼區(qū)中的SSR要多于功能基因區(qū)中的SSR，所以SSR與功能基因可能存在遺傳連鎖關(guān)系［5，15］。

關(guān)于SSR高變異性，目前主要有兩種假說：DNA聚合酶滑動錯配假說和不均等重組假說［9，11］。

SSR對于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性、保護(hù)DNA完整性、特殊轉(zhuǎn)錄因子編碼、基因重組與基因組進(jìn)化有特殊意義［4，9］。

2.2SSR標(biāo)記

微衛(wèi)星的VNTR特性與高度變異易于形成多位點(diǎn)多態(tài)性或親子代特異性位點(diǎn)的多態(tài)性，通過這些不同的變異就可發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同種間甚至于不同個體間的差異。Jeffreys最初就提出利用真核DNA中的小衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列來預(yù)測個體的特異性［14］。另外，根據(jù)SSR與結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系，使得SSR對于QTL定位、高密度遺傳圖譜構(gòu)建都有重要幫助。范云六等［16］用微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合分離群體分組分析把R55小麥中的抗條銹病基因定位在染色體1BS上，證實(shí)該抗病基因來自圓錐小麥。劉亞萍等［17］用兩對引物定位了小麥抗條銹病基因Yr24，確定了其與SSR位點(diǎn)間的遺傳距離。

SSR標(biāo)記的基本原理為將生物個體微衛(wèi)星側(cè)翼序列DNA片斷克隆、測序，根據(jù)側(cè)翼序列人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將單個座位的微衛(wèi)星擴(kuò)增出來，產(chǎn)物具有簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性（SSLP），每一擴(kuò)增位點(diǎn)代表該位點(diǎn)上的一對等位基因，通過高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳來區(qū)分該多態(tài)性。非特異性SSR標(biāo)記是利用核心序列制成的1個，2個或3個堿基組成的各10，15，30等次數(shù)的寡聚DNA探針與基因組文庫雜交，進(jìn)行檢測，經(jīng)Southern雜交，放射自顯影等步驟得到DNA指紋，實(shí)現(xiàn)對品系純度鑒定、雜交優(yōu)勢預(yù)測等研究［15］，由于其簡便易行，分析迅速，在實(shí)際中有廣泛應(yīng)用［17］。但該法不能確定單個位點(diǎn)的在基因組上的位置，不能用于基因定位研究且產(chǎn)生的譜帶過多，也不利于用計算機(jī)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計分析［14］。隨著毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis， CE）、多重PCR熒光標(biāo)記基因組掃描等新技術(shù)應(yīng)用，SSR標(biāo)記分析將更加快速便捷，同時檢測通量將大大提高。

SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于：數(shù)量豐富，近于均勻覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高，尤其適于水稻［1］、花生、小麥［3］、黃瓜［2］等特殊基因組的檢測；共顯性遺傳；樣品DNA取樣少；另外每個位點(diǎn)由設(shè)計的引物順序決定，便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物。正因如此，我國農(nóng)業(yè)部主管機(jī)構(gòu)已經(jīng)組織全國重點(diǎn)科研機(jī)構(gòu)制定了針對玉米、水稻、棉花等多種農(nóng)作物品種的SSR檢測技術(shù)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)并預(yù)計于2015推出新版標(biāo)準(zhǔn)及CE檢測平臺的全國統(tǒng)一的數(shù)據(jù)檢索信息庫以整合各地得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2.1SSR標(biāo)記的開發(fā)

SSR標(biāo)記基于PCR反應(yīng)，引物的準(zhǔn)確程度對于檢測結(jié)果非常重要［18］。位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記的建立先要構(gòu)建基因組文庫，并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計［4，19］，所以高開發(fā)成本一直是非商業(yè)化物種常規(guī)SSR標(biāo)記研究應(yīng)用的主要障礙［5］。尋找快速廉價的引物篩選方法是SSR應(yīng)用的重點(diǎn)問題［12］。

常規(guī)標(biāo)記篩選法是酶切基因組DNA，構(gòu)建小片斷基因組文庫，用合成的探針與文庫雜交鑒定微衛(wèi)星序列［3］，然后進(jìn)行陽性克隆的測序與引物設(shè)計，所設(shè)計的引物必須經(jīng)過PCR并在對應(yīng)克隆和基因組DNA中擴(kuò)增出預(yù)計產(chǎn)物，工作量相當(dāng)大。McFadden等［4］利用常規(guī)法篩選出甘藍(lán)型油菜基因組文庫，對獲得的140個陽性克隆進(jìn)行測序，設(shè)計了21對引物，有17對得到理想產(chǎn)物，13對引物擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為多態(tài)性。Marion S.等從六倍體面包小麥基因組中開發(fā)出230對引物，擴(kuò)增出279個微衛(wèi)星位點(diǎn)，有20%的標(biāo)記檢測到1個以上的位點(diǎn)［3］。

引物的獲得也可由相關(guān)文獻(xiàn)［16］或DNA數(shù)據(jù)庫如EMBL、GenBank上進(jìn)行檢測［17］，大多數(shù)農(nóng)作物都可找到對應(yīng)SSR引物。但實(shí)際檢測效果證明此類引物的檢測效果往往不如用基因組篩選獲得引物的多態(tài)性好，例如從EST獲得SSR的多態(tài)性為54%；而基因組篩選得到的SSR引物多態(tài)性達(dá)到83.8%［4］。沈金雄等［20］報道根據(jù)檢索的196對引物，有75對可篩選出產(chǎn)物，其中僅40對能檢測出1個位點(diǎn)，最多可檢測出5個位點(diǎn)；一般需要2～3對引物才能把親本材料區(qū)分開。

總的看來，SSR標(biāo)記檢測的不足在于引物的開發(fā)，另外與AFLP相比，SSR座位突變率高，容易受到趨同變異引起的平行演化的影響，可能給親緣關(guān)系評估帶來誤差，SSR分析的結(jié)果也與植物遺傳背景密切相關(guān)。

2.2.2SSR標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

近幾年已開發(fā)出多種基于SSR標(biāo)記的方法。簡單重復(fù)間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR），也稱錨定SSR（anchored simple sequence repeats）［21］，是直接利用被標(biāo)記的SSR引物，擴(kuò)增SSR間的單拷貝序列。引物設(shè)計時在5'端和3'端分別加上1-2個選擇性堿基，使得退火溫度提高，引物有更強(qiáng)的專一性，降低了雜帶的干擾，增加了擴(kuò)增特異性和試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性［1］。ISSR引物的開發(fā)不需對側(cè)翼序列單獨(dú)測序，開發(fā)費(fèi)用降低［2］，它結(jié)合了RAPD與SSR的優(yōu)點(diǎn)，耗資更少。其引物可以在不同的物種間通用而不像SSR標(biāo)記一樣有較強(qiáng)的物種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美［1，19］。ISSR廣泛應(yīng)用于多種植物的指紋圖譜繪制。Prevol等［1］用4 個ISSR標(biāo)記對34個馬鈴薯品種檢測，有兩個引物完全可以將這些品種區(qū)分開。Ammiraju等［19］通過ISSR技術(shù)已找到與小麥籽粒大小相關(guān)的QTL。

選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)（Selective Amplification of Microsatellite Polymorphism Loci，SAMPL）是SSR與AFLP相結(jié)合的分子標(biāo)記。它利用微衛(wèi)星序列設(shè)計引物，不需預(yù)先對微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行克隆和測序。方法是在AFLP反應(yīng)的第二次擴(kuò)增時將一個具有3個選擇性堿基的AFLP引物與一個16-18 bp的人工SAMPL引物組合在一起，由于SAMPL引物的特異性［12，19］，在擴(kuò)增時，SAMPL引物5'端重復(fù)提供進(jìn)行嚴(yán)格復(fù)性的5'端錨定位點(diǎn)，因而該引物的3'端的第二個微衛(wèi)星就可延伸。根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶、SSR引物及選擇性接頭引物的組合，SAMPL所揭示的多態(tài)性幾乎是無限的。與其他方法相比，其結(jié)果可能最有價值［5，15］。另外還有RAPD與SSR結(jié)合的隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性法等等。

3　SSR標(biāo)記應(yīng)用

微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛用于重要性狀基因定位及分子標(biāo)記輔助育種研究。已利用微衛(wèi)星標(biāo)記建立了與水稻抗白枯病基因、蠟質(zhì)基因，大豆抗條紋花葉病和大豆開花期基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記［1］。親緣關(guān)系鑒定方面，Manifesto等對105份小麥品種用位于不同染色體上的探針檢測后發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越近的品種，指紋譜的相關(guān)系數(shù)越高。郭旺珍等用SSR標(biāo)記對棉屬二倍體及四倍體種進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示出屬于D染色體組的擬似棉與其他D染色體組棉種的相似系數(shù)最低，A、D染色體組間相似系數(shù)很高［22］。韓麗娟等［23］在大豆疫霉菌研究中指出應(yīng)用SSR標(biāo)記確定生理小種間親緣關(guān)系是可行的。Pestson等利用18對微衛(wèi)星標(biāo)記對113份二倍體粗山羊草進(jìn)行分析，認(rèn)為微衛(wèi)星標(biāo)記非常適于遺傳多樣性分析。Diwan等［1］用20個SSR位點(diǎn)成功地將17個用AFLP未能完全區(qū)分開來的栽培大豆分開。Weising等認(rèn)為對于品種鑒別來說，SSR標(biāo)記比RAPD等標(biāo)記更加優(yōu)越，獲得的資料便于在不同實(shí)驗(yàn)室間共享。

由于PCR-SSR標(biāo)記法比RFLP更易操作和宜于實(shí)現(xiàn)自動化，所以利用很少的微衛(wèi)星即可進(jìn)行遺傳多樣性分析及系統(tǒng)進(jìn)化研究。Peil等用該標(biāo)記鑒定了普通小麥種間的代換系。而Procunier等鑒定了四倍體小麥的異附加系。值得注意的是有些微衛(wèi)星雖然是位點(diǎn)特異性的，但并不具備相應(yīng)的部分同源性，與RFLP相比，所揭示的部分同源性是很低，因而在染色體的部分同源性鑒定及比較作圖中的應(yīng)用受到了一定限制。

［1］周延清. 遺傳標(biāo)記的發(fā)展［J］.生物學(xué)通報，2000，35（5）：17-18.

［2］葛鳳偉，張海英，陳青君，等.黃瓜SSR反應(yīng)體系的建立［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2004 ，19（2）：5-9.

［3］唐榮華， 張君誠，吳為人，等. SSR分子標(biāo)記的開發(fā)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15（4）：106-109.

［4］劉列釗，林吶. 油菜簡單重復(fù)序列SSR研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2004，16（3）：173-176.

［5］ Hayden M J， et al. Targeted development of informative microsatellite markers［J］.Nucleic Acids Research，2001，29 （8）：1697-1704.

［6］張獻(xiàn)龍. 植物生物技術(shù)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，2012.

［7］賀竹梅.現(xiàn)代遺傳學(xué)教程［M］.廣州：中山大學(xué)出版社，2002.

［8］Antonio A F G. Comparison of RAPD，AFLP，RFLP，SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred line［J］.Genet and Mol Bio，2004，27（4）：3.

［9］Gábor Tóth. Microsatellite in different eukaryotic genome: Survey and analysis［M］.New York: Cold Spring Harbor Lab Press，2005.

［10］吳乃虎.基因工程原理［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，2001.

［11］孫乃恩，孫東旭，朱德煦，等. 分子遺傳學(xué)［M］.南京：南京大學(xué)出版社，1990.

［12］張志敏，熊國梅，王慧娟，等. 簡單重復(fù)序列的篩選與應(yīng)用［J］.生命的化學(xué)，2004，24（3）：254-257.

［13］He G H.Microsatellite as DNA markers in cultivated peanut［J］.BMC Plant Biology，2003（3）：3.

［14］沃克J M，拉普勒R. 分子生物學(xué)與生物技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

［15］管峰，楊利國，賈名威，等. 微衛(wèi)星的構(gòu)成及其檢測技術(shù)［J］.生物學(xué)雜志，2004，21（2）：1-3，13.

［16］范云六. 我國農(nóng)作物生物技術(shù)的成就與展望［J］.世界科技研究與發(fā)展，1999（1）：11-15.

［17］劉亞萍，曹雙河，王獻(xiàn)平，等. 小麥抗條銹病基因Yr24的SSR標(biāo)記［J］.植物病理學(xué)報，2005，35（5）：478-480.

［18］李汝玉，李群，譚振馨，等. 利用SSR標(biāo)記技術(shù)檢測玉米雜交種純度［J］.玉米科學(xué)，2005，13（1）：15-18.

［19］王建波. ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.遺傳，2002，24（5）：613-616.

［20］沈金雄，傅廷棟，楊光圣，等. 甘藍(lán)型油菜SSR、ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性及其與雜種表現(xiàn)的關(guān)系［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（4）：477-483.

［21］黎裕，賈繼增，王天宇，等. 分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展［J］.生物技術(shù)通報，1999（4）：21-24.

［22］郭旺珍，王凱，張?zhí)煺妫?利用SSR標(biāo)記技術(shù)研究棉屬A、D染色體組的進(jìn)化［J］.遺傳學(xué)報，2003 ，30（2）：183-188.

［23］韓麗娟，劉文洪. 大豆疫霉病及其遺傳多樣性的研究方法［J］.分子植物育種，2004，2（6）：877-883.

Q78

A

1002-0659（2015）05-0034-04

2015-07-08

天津市農(nóng)業(yè)局青年人才培育項目（201306）

主要作者簡介：劉何（1978-），男，農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量檢驗(yàn)工作。E-mail：23120207@qq.com