劉紫微 趙鑫 焦孟月 張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

花荵葉片愈傷組織的誘導(dǎo)1)

劉紫微 趙鑫 焦孟月 張彥妮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

以花荵(Polemoniumcoeruleum)葉片為外植體，研究了不同消毒方法對(duì)葉片白化率的影響、不同激素種類(lèi)及激素組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：較適合花荵葉片消毒的方法是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒30 s后、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaClO消毒6 min，葉片白化率低，存活率較高。葉片愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基：MS+1.0 mg·L-16-BA(6-芐氨基腺嘌呤)，誘導(dǎo)率為88.9%。

花荵；葉片愈傷組織；誘導(dǎo)培養(yǎng)基；葉片白化率

花荵(Polemoniumcoeruleum)為花荵科花荵屬多年生草本植物，一般生長(zhǎng)在海拔1 500 m以上的亞高山草甸中，分布于東北、華北等省區(qū)。株高30～80 cm，奇數(shù)羽狀復(fù)葉，互生，葉軸具狹翅，具小葉11至21片，圓錐狀聚傘花序頂生，花萼寬鐘形，先端5裂，花冠藍(lán)紫色，具有很高的觀賞價(jià)值，抗寒性強(qiáng)，是有待開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的野生花卉。在中國(guó)植物志第64卷中記載：花荵科有15屬約300種，主產(chǎn)北美洲西部，歐洲、亞洲只有很少的種類(lèi)；我國(guó)有3屬6種，其中4種系栽培。國(guó)內(nèi)外對(duì)花荵的研究多集中于其藥理作用，研究實(shí)驗(yàn)證明，花荵科植物對(duì)一些動(dòng)物的膽固醇性動(dòng)脈硬化有治療的作用，使皮膚、動(dòng)脈、肝臟、角膜及其他內(nèi)臟類(lèi)脂質(zhì)的黏著減少?；ㄇY科植物能夠使積累在細(xì)胞內(nèi)的膽固醇及時(shí)排出，起到了降低血脂的作用[1]。對(duì)同屬的宿根福祿考和叢生福祿考研究的很多，且在組織培養(yǎng)快速繁殖方面也有很多研究，已經(jīng)建立了完善的組織培養(yǎng)再生體系[2-9]；但對(duì)花荵的繁殖栽培研究很少。鑒于花荵在園林美化及醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景，有必要通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)繁，為其種質(zhì)資源保存和園林推廣應(yīng)用提供參考。本文以花荵葉片為外植體，對(duì)其進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以期為下一步完善花荵組織培養(yǎng)體系建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料：以東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院溫室里盆栽的花荵植株為母株，選用生長(zhǎng)良好的幼嫩葉片作為外植體。

外植體的消毒：選取花荵的幼嫩葉片，用加有洗滌劑的水洗2～3 min，自來(lái)水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精消毒30 s，倒去酒精，無(wú)菌水沖洗1次；再分別用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%)的次氯酸鈉(NaClO)消毒6 min，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分，將葉片剪成約1 cm2的塊，接種到MS基本培養(yǎng)基上。兩周后，統(tǒng)計(jì)污染率、白化率、存活率，篩選出適宜消毒的NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

消毒時(shí)間的選擇：用篩選出的最適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaClO消毒6、8、10 min，消毒方法同上，之后放在培養(yǎng)室培養(yǎng)。兩周后，觀察并統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、白化率，選出最適的消毒時(shí)間。

愈傷組織的誘導(dǎo)：將花荵葉片清洗消毒后，切成1 cm2左右的塊，接種到不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+6-芐氨基腺嘌呤(縮寫(xiě)6-BA)(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)；MS基本培養(yǎng)基+玉米素(縮寫(xiě)ZT)(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)；MS基本培養(yǎng)基+2,4-二氯苯氧乙酸(縮寫(xiě)2,4-D)(0.05、0.10、0.20 mg·L-1)；MS附加不同濃度6-BA、2,4-D或ZT分別與不同濃度萘乙酸(縮寫(xiě)NAA)混合成的培養(yǎng)基。20 d后，觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及葉片的變化。每種處理接種20個(gè)葉片，3次重復(fù)。白化率=(白化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；污染率=(污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和消毒時(shí)間的確定

由表1可見(jiàn)：NaClO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葉片白化率影響較大，隨著消毒劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，污染率降低，但白化率大幅度增加。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaClO處理的葉片，白化率為100%。白化率較高，主要是因?yàn)槿~片脫毒時(shí)消毒劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高或消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)葉片組織破壞[10]。綜合考慮，NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，最適宜消毒。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaClO對(duì)葉片的消毒效果

由表2可見(jiàn)：消毒時(shí)間延長(zhǎng)，增加了葉片的白化率。消毒6 min時(shí)白化率最低，污染率也相對(duì)較低。綜合考慮，NaClO的消毒時(shí)間，6 min為適宜。

表2 不同消毒時(shí)間對(duì)葉片的影響

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 不同濃度6-BA、2,4-D、ZT對(duì)花荵葉片愈傷誘導(dǎo)的影響

在培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA、2,4-D、ZT誘導(dǎo)葉片愈傷組織，結(jié)果表明(見(jiàn)表3)：激素種類(lèi)不同，誘導(dǎo)效果不同。隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率先增加后降低，愈傷組織的顏色、緊密度、長(zhǎng)勢(shì)不同。6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，葉片在培養(yǎng)17 d后，產(chǎn)生淡綠色愈傷組織，結(jié)構(gòu)緊實(shí)，長(zhǎng)勢(shì)一般；6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，在接種15 d時(shí)，出現(xiàn)淡綠色愈傷組織，結(jié)構(gòu)疏松，長(zhǎng)勢(shì)良好，誘導(dǎo)率最高(88.9%)；當(dāng)6-BA濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，葉片在培養(yǎng)15 d時(shí)，出現(xiàn)綠色愈傷組織，結(jié)構(gòu)緊實(shí)，長(zhǎng)勢(shì)一般。2,4-D濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，葉片在培養(yǎng)16 d時(shí)，出現(xiàn)淡綠色疏松狀愈傷組織，長(zhǎng)勢(shì)良好，誘導(dǎo)率為72.2%；當(dāng)2,4-D濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷組織呈綠色緊實(shí)狀，愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間為15 d，誘導(dǎo)率為66.7%；當(dāng)2,4-D濃度為0.20 mg·L-1時(shí)，在14 d出現(xiàn)綠色愈傷組織，誘導(dǎo)率為44.4%。隨著2,4-D濃度的增加，產(chǎn)生的愈傷組織顏色加深，結(jié)構(gòu)更緊實(shí)。由此可見(jiàn)，低濃度(0.05 mg·L-1)的2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，增加濃度反而抑制了愈傷組織的形成。隨著ZT濃度的增加，愈傷組織顏色由淡綠色疏松狀、綠色疏松狀、綠色緊實(shí)狀變化。愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間大致相同，均在15 d左右；愈傷組織的誘導(dǎo)率先增后降，在ZT為0.5 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高(77.8%)。綜合考慮，1.0 mg·L-16-BA誘導(dǎo)花荵葉片形成愈傷組織效果最好。

表3 6-BA、2,4-D、ZT單一激素對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2.2 不同濃度ZT和NAA對(duì)花荵葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

將花荵葉片接入不同濃度ZT和NAA組合的培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表4)：ZT濃度為0.5 mg·L-1的3種培養(yǎng)基中，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較高；NAA為0.05、0.10 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率均為66.7%。但愈傷組織在NAA濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)較好。因此，在ZT和NAA的組合中，誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳激素配比為：0.5 mg·L-1ZT+0.1 mg·L-1NAA。

表4 不同濃度ZT和NAA對(duì)愈傷組織的影響

2.2.3 不同濃度6-BA和NAA對(duì)花荵葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

將花荵葉片接種到不同濃度的6-BA和NAA的混合培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表5)：當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的增加，誘導(dǎo)率呈下降的趨勢(shì)。6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.01 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高(83.3%)，且愈傷組織為淡綠色，結(jié)構(gòu)疏松，長(zhǎng)勢(shì)好。所以，誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳6-BA和NAA的組合為：1.0 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。

表5 不同濃度6-BA和NAA對(duì)愈傷組織的影響

2.2.4 不同濃度2,4-D和NAA對(duì)花荵葉片誘導(dǎo)愈傷的影響

將葉片接種到加有不同濃度2,4-D和NAA培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表6)：在加有2,4-D的培養(yǎng)基上，葉片均產(chǎn)生愈傷組織。在2,4-D為0.05 mg·L-1、NAA為0.01 mg·L-1和0.05 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高(均為66.7%)，愈傷組織顏色為淡綠色，長(zhǎng)勢(shì)良好。隨著NAA濃度的增加，愈傷組織顏色變深，且結(jié)構(gòu)變得更緊實(shí)。而2,4-D濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較低，對(duì)于花荵葉片，0.2 mg·L-1屬于高濃度，高濃度的2,4-D會(huì)抑制愈傷組織的形成。

表6 不同濃度2,4-D和NAA對(duì)愈傷組織的影響

3 結(jié)論與討論

外植體的選擇，對(duì)于植物的組織培養(yǎng)十分重要。不同年齡、不同基因型、不同部位的外植體，對(duì)培養(yǎng)的反應(yīng)和繁殖效果有差異[11]。因花荵分枝少、葉片多，對(duì)植物觀賞性影響不大，所以本實(shí)驗(yàn)選用花荵葉片作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。在組織培養(yǎng)中，常用的消毒劑有升汞(HgCl2)、NaClO、高錳酸鉀(KMnO4)等，由于NaClO容易清洗、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，實(shí)驗(yàn)選擇NaClO作為消毒劑。消毒劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大小、消毒時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)外植體的消毒起著重要影響，而兩者之間的影響又存在著線性關(guān)系。使用3% NaClO時(shí)，白化率達(dá)到100%。消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成白化率升高(消毒10 min，白化率為32.1%)；隨著消毒時(shí)間的減少，在白化率和污染率較低時(shí)，選為適宜的消毒時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)得到的適宜消毒方法：用裝有75%酒精的無(wú)菌三角瓶中迅速?zèng)_洗30 s后，再用1%的NaClO消毒6 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，污染率為3.1%、白化率為9.3%。

植物激素種類(lèi)和濃度，對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)影響較大。本實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的ZT、6-BA、2,4-D以及它們分別與不同濃度NAA混合進(jìn)行試驗(yàn)，其中：6-BA的誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)加入NAA后三種激素的誘導(dǎo)效果都有所下降，但相對(duì)而言，低濃度(0.01 mg·L-1)有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。這一結(jié)果與宋利偉等[12]的研究結(jié)果不同。多數(shù)研究認(rèn)為，2,4-D是影響愈傷組織質(zhì)量及愈傷組織分化能力的重要因子，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著2,4-D濃度的增加誘導(dǎo)率增高[13]。但對(duì)花荵葉片，低濃度(0.05 mg·L-1)的誘導(dǎo)效果好，且在本實(shí)驗(yàn)中其誘導(dǎo)效果不如6-BA和ZT。再次說(shuō)明，基因型不同，激素的誘導(dǎo)效果不同。每種植物都要進(jìn)行激素種類(lèi)和濃度的探究。對(duì)于目前得到的愈傷組織進(jìn)一步分化，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

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Callus Induction from Leaves ofPolemoniumcoeruleum//

Liu Ziwei, Zhao Xin, Jiao Mengyue, Zhang Yanni

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(9)：45-47.

We used the leaves ofPolemoniumcoeruleumto study the effects of different disinfection method, different hormone type and hormone combination on callus induction from leaves. The best disinfection method was with 75% ethanol for 30 s and 0.1% NaClO for 6 min, the leaf bleaching rate was low, and the survival rate was high. Optimal callus induction medium was MS medium with 1.0 mg·L-16-BA with the induction rate of 88.9%.

Polemoniumcoeruleum; Callus induction from leaf; Induction medium; Leaf bleaching rate

1)黑龍江省留學(xué)歸國(guó)基金項(xiàng)目(LC201410)。

劉紫薇，女，1992年2月生，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，學(xué)士本科生。E-mail：1696275141@qq.com。

張彥妮，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail：ynzhang808@126.com。

2015年6月30日。

Q943.1

責(zé)任編輯：張 玉。