過(guò)偉民，程 森，張 駿，高 遠(yuǎn)，陳 健，張艷玲，尹啟生，孫 平*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海市楊浦區(qū)長(zhǎng)陽(yáng)路717 號(hào) 200082

烤煙分級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［1］對(duì)葉片結(jié)構(gòu)的定義為細(xì)胞排列的疏密程度，對(duì)身份的定義為煙葉厚度、細(xì)胞密度或單位面積的質(zhì)量，油分指煙葉細(xì)胞內(nèi)含有的一種柔軟半液體或液體物質(zhì)。朱尊權(quán)［2］、于華堂等［3］認(rèn)為成熟度好的煙葉葉片細(xì)胞呈疏開(kāi)狀。因此，以細(xì)胞形態(tài)特征為代表的煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)與外觀品質(zhì)指標(biāo)成熟度、葉片結(jié)構(gòu)、身份、油分等密切相關(guān)。目前，有關(guān)煙葉微觀結(jié)構(gòu)特征的研究主要集中在煙草品種［4-5］、大田期植煙土壤［6］和土壤改良措施［7］對(duì)鮮煙葉顯微/超顯微結(jié)構(gòu)的影響方面，依據(jù)煙葉微觀結(jié)構(gòu)特征確定采收成熟度［8］和烘烤工藝［9］等。煙葉烘烤過(guò)程中由于水分和營(yíng)養(yǎng)的雙重脅迫作用，使細(xì)胞失水、破裂和皺縮，微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，而關(guān)于烤后煙葉微觀結(jié)構(gòu)特征的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道，僅過(guò)偉民等［10］建立了烤后煙葉表面細(xì)胞形態(tài)特征指標(biāo)的量化方法，并比較了我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)中部初烤煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征的相似性和差異性。

利用掃描電鏡（SEM）觀察植物器官表皮的微形態(tài)學(xué)特征，已廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育和品質(zhì)形成的研究中［11-12］?；谲浖幚淼膱D像量化技術(shù)在巖石分類(lèi)、成分分析、空隙率分析等方面也有廣泛應(yīng)用［13-15］。為此，以掃描電鏡圖像的軟件量化處理為手段，通過(guò)分析不同外觀品質(zhì)煙葉樣品的表面微觀結(jié)構(gòu)特征，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立基于表面微觀結(jié)構(gòu)特征的外觀品質(zhì)預(yù)測(cè)模型，為明確煙葉外觀品質(zhì)差異的成因和建立煙葉外觀品質(zhì)的客觀、量化評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集2013年云南保山、昭通和河南許昌3 個(gè)產(chǎn)區(qū)初烤煙葉樣品，等級(jí)為C2F、C3F、C2L、B1F、B2F 和B2L。樣品采集完成后，分別制備各產(chǎn)區(qū)不同外觀品質(zhì)的煙葉樣品。方法：將各產(chǎn)區(qū)同一部位不同等級(jí)煙葉樣品混合后，根據(jù)外觀品質(zhì)因素，如成熟度、葉片結(jié)構(gòu)、身份和油分的不同，每個(gè)品質(zhì)因素指標(biāo)制備2～3 組不同檔次的煙葉樣品，共制備樣品10 組30 個(gè)。

模型驗(yàn)證采用的樣品為2012年和2013年云南（曲靖、臨滄）、貴州（黔西南、銅仁）、福建（三明）、湖南（郴州）、廣東（韶關(guān)）、湖北（十堰）、河南（許昌、平頂山）、山東（臨沂）、吉林（延邊）、遼寧（丹東）等產(chǎn)區(qū)C3F 等級(jí)煙葉樣品。

1.2 分析方法

1.2.1 煙葉SEM 圖像采集與處理

將待測(cè)煙葉在恒溫恒濕條件下平衡含水率至16%左右，在葉片相同位置（從葉基部至頂部2/3，左右兩側(cè)距離主脈2 cm）截取無(wú)雜色、病斑、損傷、含青和支脈，大小為1 cm×1 cm 的葉片。利用日立TM3030 型掃描電子顯微鏡觀測(cè)，保存圖片格式為BMP（24 bit），放大倍數(shù)450 倍，由于不可避免地存在圖像對(duì)比度不明顯及偏光問(wèn)題，因此參考文獻(xiàn)［10］統(tǒng)一進(jìn)行煙葉SEM圖像的對(duì)比度及偏光處理。

1.2.2 煙葉外觀品質(zhì)評(píng)價(jià)

參照中國(guó)煙草種植區(qū)劃——烤煙外觀質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［16］進(jìn)行煙葉外觀品質(zhì)評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，樣本之間多重比較采用最小顯著差異法（LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉樣品外觀品質(zhì)量化評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)制備煙葉樣品的外觀品質(zhì)因素進(jìn)行定量賦分，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 看出，根據(jù)外觀因素如油分、葉片結(jié)構(gòu)、身份和成熟度所制備的不同檔次煙葉樣品組，多數(shù)樣品組目標(biāo)差異因素量化分值的變異系數(shù)高于其他因素，說(shuō)明所制備煙葉樣品基本體現(xiàn)了對(duì)應(yīng)外觀因素的差異。

表1 不同外觀品質(zhì)煙葉的外觀量化評(píng)價(jià)結(jié)果 （分）

表1 （續(xù)） （分）

2.2 不同外觀品質(zhì)煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征差異分析

2.2.1 成熟度

不同成熟度煙葉樣品的表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)量化結(jié)果見(jiàn)表2。從表2 看出，隨煙葉成熟度的提高，細(xì)胞形狀參數(shù)指標(biāo)呈上升趨勢(shì)，3 組樣品中成熟度好的煙葉細(xì)胞形狀參數(shù)指標(biāo)均顯著高于成熟度差的煙葉，提高幅度在9.7%～38.3%之間。細(xì)胞大小、細(xì)胞密度和氣孔密度隨煙葉成熟度變化的規(guī)律不明顯。說(shuō)明在產(chǎn)地、部位一致的條件下，隨成熟度的提高，煙葉表面細(xì)胞形狀存在趨向不規(guī)則的變化趨勢(shì)。

2.2.2 葉片結(jié)構(gòu)

不同葉片結(jié)構(gòu)煙葉樣品表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 看出，許昌的兩個(gè)樣品組，隨煙葉葉片結(jié)構(gòu)疏松程度的改善，細(xì)胞面積和周長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，保山樣品組葉片結(jié)構(gòu)疏松程度中等和好的煙葉細(xì)胞面積和周長(zhǎng)顯著低于疏松程度差的煙葉，3 組樣品中葉片結(jié)構(gòu)疏松程度好的煙葉細(xì)胞面積較疏松程度差的煙葉低13.3%～52.7%。細(xì)胞形狀參數(shù)、細(xì)胞密度、氣孔密度隨煙葉葉片結(jié)構(gòu)變化的規(guī)律不明顯。說(shuō)明在產(chǎn)地、部位一致的條件下，疏松程度好的煙葉細(xì)胞相對(duì)小于疏松程度差的煙葉。

表2 不同成熟度煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果①

表3 不同葉片結(jié)構(gòu)煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果

2.2.3 身份

不同身份煙葉樣品表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果見(jiàn)表4。從表4 看出，隨煙葉身份由稍薄～中等的變化，氣孔密度呈下降趨勢(shì)，身份稍薄煙葉的細(xì)胞形狀參數(shù)高于身份適中的煙葉，兩組樣品中身份稍薄的煙葉細(xì)胞形狀參數(shù)均顯著高于身份適中的煙葉。細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)、細(xì)胞密度隨煙葉身份變化的規(guī)律不明顯。說(shuō)明在產(chǎn)地、部位一致的條件下，隨身份由稍薄向中等變化，煙葉氣孔密度有所下降，細(xì)胞形狀存在趨向規(guī)則的變化趨勢(shì)。

表4 不同身份煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果

2.2.4 油分

不同油分煙葉樣品表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果見(jiàn)表5。從表5 看出，兩組樣品中油分差的煙葉細(xì)胞面積和周長(zhǎng)均顯著高于油分較好的煙葉，細(xì)胞密度也相對(duì)較低。細(xì)胞形狀參數(shù)、氣孔密度隨煙葉油潤(rùn)感變化的規(guī)律不明顯。說(shuō)明在產(chǎn)地、部位一致的條件下，油分較好的煙葉細(xì)胞相對(duì)較小，細(xì)胞密度相對(duì)較大。

表5 不同油分煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的量化結(jié)果

2.3 煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)與外觀品質(zhì)的相關(guān)分析

對(duì)中部煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)量化結(jié)果與外觀品質(zhì)因素賦分分值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表6。從外觀品質(zhì)因素與細(xì)胞形態(tài)特征指標(biāo)的相關(guān)性來(lái)看，成熟度、葉片結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)特征的關(guān)系比身份和油分與細(xì)胞形態(tài)特征的關(guān)系更為密切，其中葉片結(jié)構(gòu)分值與細(xì)胞面積極顯著負(fù)相關(guān)，成熟度分值與細(xì)胞形狀參數(shù)指標(biāo)極顯著正相關(guān)。

表6 不同外觀品質(zhì)煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)與外觀品質(zhì)因素的簡(jiǎn)單相關(guān)分析①（n=21）

2.4 基于表面微觀結(jié)構(gòu)特征的煙葉外觀品質(zhì)回歸預(yù)測(cè)模型

2.4.1 最優(yōu)回歸預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

分別以成熟度、葉片結(jié)構(gòu)、身份、油分分值及相關(guān)程度較高的兩指標(biāo)（成熟度和葉片結(jié)構(gòu)）分值加和為因變量，煙葉表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析。通過(guò)比較不同外觀品質(zhì)因素回歸預(yù)測(cè)方程的決定系數(shù)、顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以細(xì)胞面積、細(xì)胞周長(zhǎng)和細(xì)胞形狀參數(shù)為自變量，可較好地實(shí)現(xiàn)煙葉成熟度和葉片結(jié)構(gòu)分值加和回歸預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建。回歸方程各自變量的偏回歸系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤差和檢驗(yàn)結(jié)果等見(jiàn)表7。線性回歸方程為：

表7 煙葉成熟度和葉片結(jié)構(gòu)綜合狀況的回歸模型參數(shù)檢驗(yàn)（n=21）

2.4.2 回歸模型的檢驗(yàn)

分別采用建模樣品和驗(yàn)證樣品對(duì)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行檢驗(yàn)。從圖1 和圖2 可以看出，利用建模樣品和驗(yàn)證樣品得到的煙葉成熟度與葉片結(jié)構(gòu)分值加和的預(yù)測(cè)值與實(shí)際評(píng)價(jià)值均極顯著或顯著正相關(guān)，建模樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)際評(píng)價(jià)值的平均絕對(duì)誤差為0.54 分，平均相對(duì)誤差3.18%，驗(yàn)證樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)際評(píng)價(jià)值的平均絕對(duì)誤差為1.06分，平均相對(duì)誤差6.20%。由于煙葉外觀品質(zhì)因素量化評(píng)價(jià)時(shí)，單一品質(zhì)因素的記分單位為0.5，因此模型的預(yù)測(cè)偏差在0.5～1.0 個(gè)計(jì)分單位，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較好。

圖1 建模樣品預(yù)測(cè)值和評(píng)價(jià)值的擬合

圖2 驗(yàn)證樣品預(yù)測(cè)值和評(píng)價(jià)值的擬合

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)不同外觀品質(zhì)因素?zé)熑~樣品的制備與分析，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)地、部位一致的條件下，隨煙葉成熟度提高，細(xì)胞形狀呈不規(guī)則變化趨勢(shì)。這與朱尊權(quán)［2］、于華堂等［3］認(rèn)為成熟度好的煙葉細(xì)胞呈疏開(kāi)狀態(tài)相吻合。此外，葉片結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松的煙葉細(xì)胞小于疏松程度較差的煙葉，身份相對(duì)適中的煙葉細(xì)胞形狀較身份偏薄的煙葉規(guī)則、氣孔密度較小，油潤(rùn)感較強(qiáng)的煙葉細(xì)胞相對(duì)小于油潤(rùn)感較弱的煙葉，這些研究結(jié)果與過(guò)偉民等［10］對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)煙葉的分析結(jié)果基本一致。由于葉片結(jié)構(gòu)定義為細(xì)胞排列的疏密程度［1］，細(xì)胞排列間隙大，則葉片結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松；細(xì)胞面積較大時(shí)，細(xì)胞排列可能相對(duì)緊密，細(xì)胞間隙相對(duì)減少，造成葉片結(jié)構(gòu)的疏松程度變差。而在油潤(rùn)感方面，于華堂等［3］認(rèn)為油分是煙葉組織細(xì)胞內(nèi)含有的一種柔軟液體或半液體物質(zhì)，可能是由于細(xì)胞面積較大時(shí)，細(xì)胞單位面積的柔軟液體或半液體物質(zhì)含量相對(duì)減少，從而造成煙葉的油潤(rùn)感變差。

（2）通過(guò)逐步回歸分析比較了基于表面微觀結(jié)構(gòu)特征指標(biāo)的煙葉不同外觀品質(zhì)因素的預(yù)測(cè)效果，發(fā)現(xiàn)針對(duì)煙葉單一品質(zhì)因素目前尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)回歸建模，需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行后續(xù)研究。利用表面微觀指標(biāo)可較好地實(shí)現(xiàn)煙葉成熟度和葉片結(jié)構(gòu)綜合狀況的預(yù)測(cè)，建模樣品和驗(yàn)證樣品預(yù)測(cè)值與實(shí)際評(píng)價(jià)值的平均相對(duì)誤差分別為3.18%和6.20%。

（3）在模型的驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與建模樣品的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率相比，驗(yàn)證樣品的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率有所下降，可能與驗(yàn)證樣品涵蓋的產(chǎn)區(qū)較多、不同產(chǎn)區(qū)煙葉微觀結(jié)構(gòu)特征的區(qū)域性差異對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果存在影響有關(guān)。因此，有待于進(jìn)一步加大樣本量對(duì)模型進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

［1］GB/T 2635—1992 烤煙［S］.

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