吳曉黎，王智敏，梁鶴繽，郝穎，鄭東明，郭陽

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110021）

·論著·

PARP抑制劑對糖尿病大鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用

吳曉黎，王智敏，梁鶴繽，郝穎，鄭東明，郭陽

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110021）

目的研究PARP抑制劑3-氨基苯甲酰（3-AB）對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿?。―M）大鼠皮層神經(jīng)元的作用及機(jī)制。方法將60只大鼠隨機(jī)分假手術(shù)對照組、DM組和DM+3-AB組，每組20只。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用紫外分光光度計(jì)法測定皮層組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量，采用Western blot法檢測皮層PARP1蛋白表達(dá)水平，采用免疫組化法檢測皮層caspase-3表達(dá)變化。結(jié)果DM組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。DM組的SOD和GSH-Px含量顯著低于對照組（P＜0.01），MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01），DM+3-AB組的SOD和GSH-Px含量明顯高于DM組（P＜0.05），MDA含量明顯低于DM組（P＜0.05）。DM組的PARP1表達(dá)顯著增加（P＜0.01），DM+ 3-AB組的PARP1表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。DM組的caspase-3表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.01），DM+3-AB組的caspase-3表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論3-AB通過抑制PARP1，減輕DM導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，減少皮層神經(jīng)元凋亡。

糖尿?。籔ARP；認(rèn)知障礙；氧化應(yīng)激

隨著人們生活方式的改變和人口老齡化，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）發(fā)病率呈逐年上升趨勢。DM并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注［1，2］。早在1922年Miles等［3］就報(bào)道了DM相關(guān)認(rèn)知障礙。Bestetti等［4，5］發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有顯著的結(jié)構(gòu)變化。Jakobsen等［6］發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM大鼠有大量皮層神經(jīng)元缺失。Li等［7］認(rèn)為神經(jīng)元凋亡與大鼠認(rèn)知有關(guān)，2個(gè)月自發(fā)DM的BB/Wor大鼠無神經(jīng)元凋亡，也不伴有認(rèn)知障礙，而8個(gè)月的BB/Wor大鼠神經(jīng)元凋亡增加，認(rèn)知功能受損。DM導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚不明確，高血糖會(huì)導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxy-gen species，ROS）過量產(chǎn)生，使多個(gè)組織發(fā)生氧化應(yīng)激。最近有研究表明，氧化應(yīng)激最終有可能是通過激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase1，PARP1］而發(fā)揮作用［8］。

PARP是一種富含核染色質(zhì)的多功能酶，分子量為113～116 kDa，它的作用是識別DNA的缺口后結(jié)合到DNA的受損處。在生理狀態(tài)下PARP的活性很低，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)被過度活化，會(huì)耗竭細(xì)胞內(nèi)能量，激活細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9］。PARP1是否參與DM大鼠皮層神經(jīng)元凋亡鮮有報(bào)道。本研究中我們應(yīng)用鏈脲佐菌素介導(dǎo)的DM大鼠模型，觀察PARP抑制劑3-氨基苯甲酰（3-aminobenzamide，3-AB）對DM大鼠皮層神經(jīng)元的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈脲佐菌素和3-AB（美國Sigma-Aldrich公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）（南京建成生物工程研究所）；PARP1多克隆抗體試劑盒、鼠抗caspase-3抗體、小鼠抗大鼠β-actin抗體、PARP1單克降抗體（美國Santa Cruz公司）；SABC試劑盒、DAB顯色劑、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（北京中山公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

清潔級3月齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、DM組和DM+3-AB組，每組20只。DM大鼠模型制備前大鼠禁食12 h，給予單次腹腔注射溶解于pH 4.0～4.2、濃度為0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中的鏈脲佐菌素，劑量為55 mg/kg。對照組注入相同劑量的生理鹽水。注射后所有大鼠放入代謝籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。大鼠血糖持續(xù)超過16.7 mmol/L、尿糖試紙（+++）的大鼠為DM大鼠。DM+3-AB組給予腹腔注射3-AB（20 mg·kg-1·d-1），持續(xù)3個(gè)月，對照組和DM組給予腹腔注射等量生理鹽水。3個(gè)月后取材。

1.3 認(rèn)知功能測定

采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)：選擇1個(gè)象限的固定位置將大鼠面向池壁放入水中，通過自動(dòng)圖像拍攝系統(tǒng)記錄游泳軌跡，記錄大鼠入水至找到平臺的時(shí)間，即逃避潛伏期。120 s找不到平臺，潛伏期記錄為120 s。其總行程為游泳距離。實(shí)驗(yàn)2次/d，歷時(shí)4 d，第5天測試。

1.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練完畢次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)穿過原平臺的次數(shù)，反映空間記憶能力。

1.4 皮層組織SOD、GSH-Px和MDA含量測定

每組各取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后取腦，分離出大腦皮質(zhì)，-80℃保存。SOD活力、MDA含量的測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，用紫外分光光度計(jì)法測定。

1.5 Western blot法檢測各組腦組織PARP1蛋白表達(dá)水平的變化

每組各取5只大鼠，頸椎脫臼處死、斷頭、剝離并取出大腦皮質(zhì)，稱取各組標(biāo)本100 g，剪碎加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液500 μL，超聲粉碎。4℃、12 000 r/min離心0.5 h，取上清。采用酚試劑法測定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，用含5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃1 h。一抗（1∶500）4℃過夜。洗膜，并加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫下2 h。TTBS清洗2次，每次5 min；TBS洗1次，5 min。酶顯法顯色。使用ChemiImager 5500 V3.0軟件進(jìn)行圖像灰度掃描，F(xiàn)luor Chem 2.0分析軟件進(jìn)行分析，獲取目的條帶和內(nèi)參照GADPH的整合光密度值，以兩者的比值作為蛋白表達(dá)半定量指標(biāo)。

1.6 免疫組化法檢測caspase-3表達(dá)變化

每組各取5只大鼠麻醉，開胸，用生理鹽水灌流后4%多聚甲醛灌注固定。取腦置于上述固定液中固定24 h，再將標(biāo)本置于30%蔗糖中沉淀24 h。組織塊在恒冷切片機(jī)上切片。免疫組化操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

DM組大鼠逃避潛伏期和空間探索時(shí)間較對照組顯著延長（P＜0.01），學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損。DM+3-AB組大鼠逃避潛伏期和空間探索時(shí)間顯著縮短（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和空間探索時(shí)間的比較Tab.1 The escape latency and spatial probe test by Morris water maze test

2.2 各組大鼠皮質(zhì)SOD、GSH-Px和MDA的含量

DM組的SOD和GSH-Px含量顯著低于對照組（P＜0.01）；DM+3-AB組的SOD和GSH-Px含量明顯低于對照組（P＜0.05），明顯高于DM組（P＜0.05）。DM組的MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01）；DM+ 3-AB組的MDA含量明顯高于對照組（P＜0.05），明顯低于DM組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組腦組織中SOD、GSH-Px、MDA、PARP1和caspase-3含量的變化Tab.2 Changes in expression of SOD，GSH-Px，MDA，PARP1 and caspase-3 in brain tissues in each group

2.3 各組大鼠PARP1蛋白的表達(dá)

與對照組相比，DM組的PARP1的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與DM組相比，DM+3-AB組的PARP1的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），見圖2、表2。

圖2 各組大鼠皮層中PARP1的表達(dá)Fig.2 Expression of PARP1 in cortex in each group

2.4 各組大鼠皮層中caspase-3的表達(dá)

與對照組相比，DM組的caspase-3的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與DM組相比，DM+3-AB組的caspase-3的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），見圖3、表2。

3 討論

大量研究已發(fā)現(xiàn)DM相關(guān)的認(rèn)知障礙問題，而且研究還發(fā)現(xiàn)DM患者存在一系列神經(jīng)心理學(xué)改變。對于1型DM患者，最常見的是學(xué)習(xí)能力、記憶力、解決問題能力等功能受損［10］。已有報(bào)道在1型DM患者大腦皮層可見彌漫性或局灶性的退化性變，如神經(jīng)元的丟失、脫髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)增生等［11，12］。影像學(xué)也證實(shí)了腦溝增寬、側(cè)腦室擴(kuò)大、腦白質(zhì)疏松等變化［13］。

圖3 各組大鼠皮層中caspase-3的表達(dá) ×200Fig.3 Expression of caspase-3 in cortex in each group×200

盡管DM導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡的發(fā)病機(jī)制尚不明確，氧化應(yīng)激是重要機(jī)制。機(jī)體存在兩類抗氧化系統(tǒng)，一類是非酶抗氧化系統(tǒng)，包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽等；一類是酶抗氧化系統(tǒng)，包括SOD、過氧化氫酶、GSH-Px等。人體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。DM時(shí)升高的血糖導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量ROS，ROS是一種強(qiáng)氧化劑，過量的ROS使氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ROS能夠觸發(fā)DNA斷裂，輕微的DNA損害激活PARP-1，這有利于DNA的修復(fù)及細(xì)胞的存活。但DM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激使PARP過度活化，從而耗竭ATP，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，直至死亡［14］。研究已經(jīng)證實(shí)，PARP抑制劑能在氧化應(yīng)激的細(xì)胞中抑制或滅活PARP并能保存細(xì)胞中的NAD+及ATP。在這種情況下，細(xì)胞能保持正常的形態(tài)，保護(hù)細(xì)胞避免壞死。

本研究通過鏈脲佐菌素單次腹腔注射建立DM模型，結(jié)果顯示：DM組的SOD和GSH-Px含量顯著降低，MDA和PARP1的含量顯著增加，表明DM大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，PARP1被激活。免疫組化顯示皮層內(nèi)caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)，表明DM誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元的死亡增多。給予3-AB后PARP1明顯減少，SOD和GSH-Px含量顯著升高，而MDA含量降低，說明3-AB抑制PARP1的活性，明顯抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。DM+3-AB組皮層內(nèi)caspase-3的表達(dá)減少，表明3-AB減少DM誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，保護(hù)皮層神經(jīng)元。

綜上所述，氧化應(yīng)激和PARP-1的活化在DM皮層神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用。PARP-1抑制劑通過抑制PARP的活性，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)皮層神經(jīng)元，延緩病變的發(fā)展，可能是治療DM新的途徑。

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（編輯陳姜）

Protective Effect of PARP Inhibitor on Cortical Neurons in Streptozotocin-induced Diabetic Rats

WU Xiao-li，WANG Zhi-min，LIANG He-bin，HAO Ying，ZHENG Dong-ming，GUO Yang

（Department of Neurology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110021，China）

Objective To investigate the effect of PARP inhibitor 3-aminobenzamide（3-AB）on cortical neurons in streptozotocin-induced diabetes mellitus（DM）rats and the mechanism.M ethodsA total of 60 rats were divided into 3 groups randomly：sham-operated control group，DM group and DM+3-AB group，20 rats in each group.Morris maze was used to detect learning and memory abilities in each group.Spectrophotometer assay was used to detect the levels of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and malondialdehyde（MDA）in cortex.Western blot was used to determine the expression of poly（ADP-ribose）polymerase 1（PARP1）in cortex.Immunohistochemical staining was used to determine the expression of caspase-3-immunoreactive neurons in cortex.ResultsDM rats showed significantly declined learning and memory abilities.Compared with the control group，the levels of SOD and GSH-Px were significantly reduced（P＜0.01）and the level of MDA was significantly up-regulated（P＜0.01）in the DM group.Compared with the DM group，the levels ofSOD and GSH-Px were significantly higher（P＜0.05）and the level of MDA was significantly lower in the DM+3-AB group（P＜0.05）.The expression level of PARP1 was significantly up-regulated in the DM group and was significantly decreased in the DM+3-AB group（P＜0.01）.The level of caspase-3 was significantly higher in the DM group than in the control group（P＜0.01），and was significantly decreased in the DM+3-AB group（P＜0.01）.Conclusion3-AB protected cortical neurons from apoptosis in DM rats by inhibition of PARP1 and alleviation of oxidative stress.

diabetes mellitus；poly（ADP-ribose）polymerase；cognitive impairment；oxidative stress

R743.32

A

0258-4646（2015）06-0481-04

國家自然科學(xué)基金（81000467）

吳曉黎（1973-），女，講師，博士. E-mail：77kwuxiaoli@163.com

2015-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：