沈克鋒 劉 宏 師柳明

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西太原030000；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院普通外科，山西太原030000

血小板在異種移植凝血功能障礙中聚集的機制

沈克鋒1△劉 宏2▲師柳明1△

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西太原030000；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院普通外科，山西太原030000

GTKO豬的成功培育解決了超急性排斥反應（hyperacute rejection，HAR）的問題，是異種器官移植領(lǐng)域的重大進展。但隨后發(fā)生的延遲性異種移植排斥反應（delayed xenograft rejection，DXR）成為阻礙異種移植成功的障礙。DXR主要表現(xiàn)為凝血功能障礙，其主要的病理特征是移植物內(nèi)異常的凝血、血栓形成以及消耗性凝血疾病。血小板活化和聚集在豬-非人靈長類異種器官移植的凝血功能失調(diào)及血栓性微血管病的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本文旨在探討血小板在延遲性異種移植排斥反應中聚集的機制。

血小板；聚集；凝血；異種移植；機制

器官移植是目前治療器官功能衰竭的主要手段，但由于供體器官嚴重短缺，大部分患者不能及時接受治療。因此開展異種器官移植及異種移植供體的研究是近年來的熱點問題。豬是迄今認為發(fā)現(xiàn)的最為適合的異種移植提供體。豬的肝臟、胰島及腎臟等器官與人類的相比較，在大小、組織和細胞結(jié)構(gòu)甚至功能上非常接近。豬繁殖快，易于喂養(yǎng)、價格便宜等優(yōu)勢能滿足器官移植的需要。

1 DXR是異種移植失敗的原因，實質(zhì)是凝血功能障礙，其中血小板在凝血功能障礙中發(fā)揮重要作用

1.1 目前阻礙異種器官移植成功的主要原因是凝血功能障礙

α1，3-半乳糖是最重要的異種移植抗原[3]，由α1，3 -半乳糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)糖基化修飾后得到。α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶系由GALT基因編碼?？茖W家們將野生型豬的GALT基因敲除后成功培育出GTKO豬。這解決了HAR的問題，是異種器官移植領(lǐng)域的重大進展[1]。

GTKO豬去除了主要的異種抗原，但這并沒有解決凝血功能失調(diào)及血管損傷的問題[4]。主要原因是發(fā)生了DXR[2]，其發(fā)生在控制HAR的異種移植物在恢復血流24 h內(nèi)，移植后幾天至幾周內(nèi)被移植的器官喪失活性的過程[5]。DXR主要表現(xiàn)為嚴重的血栓性微血管病變和彌漫性血管內(nèi)凝血。

1.2 血小板在異種移植凝血功能障礙中起著重要的作用

在排斥GTKO豬的異種器官移植中，我們總會找到血栓形成及血小板聚集的證據(jù)。血小板減少是異種肝移植中非常棘手的問題。4只被免疫抑制的狒狒在接受GTKO/CD46豬肝異種移植術(shù)后于5 h后開始出現(xiàn)血小板減少，在術(shù)后5～7 d由于消耗性凝血功能障礙（consumptive coagulopathy，CC）而死亡或被安樂死，而被移植的器官是“有功能的”[6]。另一項體外實驗中，豬肝臟被灌注了凈化了的人血小板，自試驗開始后15 min內(nèi)93%的血小板消失了，早期的活組織檢查發(fā)現(xiàn)肝臟血管內(nèi)皮細胞對新鮮的血小板有吞噬作用，而這也被體內(nèi)試驗證實[7]?？傊@些實驗都證明血小板在DXR的發(fā)展過程中扮演重要角色[3]。

1.3 血小板的結(jié)構(gòu)及功能

血小板有復雜的結(jié)構(gòu)和組成。血小板膜呈脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，附著或鑲嵌有多種糖蛋白（glycopro tein）。GPIb/IX復合物是一個重要的膜受體，可以通過識別血管內(nèi)皮細胞下的血管性假血友病因子（vWF），使血小板粘附到血管的受損處[8]。GPIIb/IIIa復合物可以通過纖維蛋白原介導血小板與血小板間的聚集[9]，只有活化狀態(tài)的GPIIb/IIIa才能與血漿纖維蛋白原相互作用[10]。纖維蛋白原受體才能與GPIIb/IIIA作用還需要鈣離子的參與，從而引起血小板聚集。血小板內(nèi)散在著致密顆粒，血小板致密顆粒分泌的ADP可通過P2Y12受體招募其他血小板聚集損傷部位[11]。

2 異種移植中導致血小板聚集的機制

2.1 非免疫依賴途徑，豬-人類分子的不相容性可以導致血小板聚集

在正常情況下，人vWF并不能引起人血小板聚集。然而體外條件下，豬vWF在沒有任何激動劑的情況下能夠誘導人血小板聚集，這可能是由于人與豬vWF物種間的差異性造成的。vWF的O-糖基化A1結(jié)構(gòu)域和GPIb之間的異常接觸會引起人血小板自發(fā)性聚集[12]。豬vWF與人血小板質(zhì)膜GPIb結(jié)合導致Ca2+濃度增加，同時暴露出血小板質(zhì)膜GPIIb/IIIa受體，此時纖維蛋白原便能夠與GPIIb/IIIa受體結(jié)合[13]。在體外建立豬-人肺異種器官移植模型，經(jīng)過去氨加壓素預處理的豬肺，可降低vWF含量，減弱血小板聚集和血管內(nèi)凝血反應[14]。

2.2 凝血因子誘導血凝血小板的聚集

凝血因子的活化是生理性止血過程的重要組成部分。凝血的觸發(fā)通過體內(nèi)和體外兩種途徑進行，最終生成凝血酶。凝血酶可以使纖維蛋白原水解為纖維蛋白單體，纖維蛋白多聚體可以網(wǎng)羅血小板及血細胞。研究認為豬凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ及Ⅻ的活性比人類的要高[15]，提示在以豬作為供體時更容易導致凝血功能障礙。在體外實驗，富含豬凝血因子Ⅷ的血漿能誘導人血小板聚集。因子Ⅷ是由兩個部分構(gòu)成的復合體。低分子量的部分具有促凝血活性，而高分子量的部分是蛋白vWF活性載體[16]。因子Ⅷ發(fā)揮生理功能需要vWF的協(xié)助。vWF作為因子Ⅷ的載體蛋白，起著保護它免受蛋白酶降解的作用。有報道認為，凝血酶原通過離子依賴的方式與血小板表面糖蛋白特異性地結(jié)合，也可介導血小板的聚集反應[17]。

2.3 補體成分參與血小板的聚集

補體可以增加凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化間接誘導血小板聚集[18]。補體C1q與膠原蛋白或免疫復合物作用，在調(diào)解血小板聚集中發(fā)揮重要作用[19]。C1q和膠原蛋白競爭性識別血小板上特異性位點，所以單體C1q可抑制膠原誘導的血小板聚集[20]。但單體C1q不能觸發(fā)血小板聚集[21]，可能因為它是無法構(gòu)成一個穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而這是血小板聚集必需的[22]。

2.4 免疫復合物介導的血小板聚集

抗體IgG通過與血小板膜表面的FcγR結(jié)合可以誘導血小板聚集及炎癥介質(zhì)的釋放。相反，阻斷免疫復合物與FcγR的結(jié)合可以抑制血小板的聚集[23]。非靈長類動物的血小板與免疫復合物結(jié)合之后可以觀察到血小板聚集和釋放。

2.5 細胞因子參與血小板的聚集

豬外周血單核細胞可以通過凝血酶來引起血小板聚集[24]，表達于豬外周血單核細胞表面的TFPI可以抑制單核細胞生成TF，因此TF和TFPI之間的失衡會導致凝血功能障礙及血小板的一場聚集。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的必要條件是必須將豬外周血單核細胞置于人血漿中，而經(jīng)過洗滌的血小板不會出現(xiàn)聚集現(xiàn)象[25]。炎癥介質(zhì)TNF-α可以作用于白細胞，導致白細胞表達P-選擇素，最后引起血小板聚集[26]。而抗-P-選擇素的物質(zhì)可以阻止血小板聚集[27]。此外，豬血栓調(diào)節(jié)蛋白能夠與人凝血酶和蛋白C結(jié)合，但人-豬血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物對蛋白C激活作用較弱。這種較弱的激活作用反而產(chǎn)生有助于增強凝血酶的活性。

2.6 豬血管內(nèi)皮細胞是引起異種移植物損傷的重要成分

人血小板可以被豬血管內(nèi)皮下的膠原、vWF、凝血酶及活化的補體等激活[28，29]。最近的數(shù)據(jù)表明，靈長類動物血小板與豬內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，以抗體和補體非依賴的方式參與血小板的激活，具體機制仍在調(diào)查中，這與傳統(tǒng)的豬vWF對人血小板的作用不同。二磷酸核苷酸還原酶CD39可以將ATP還原為ADP，而5’-外切酶CD73可以將ADP剪切為AMP，這些現(xiàn)象在活化的豬血管內(nèi)皮細胞已經(jīng)被觀察到[31]，所以對ADP的降解失敗會加劇血小板活化和聚集。CD39的替代性物質(zhì)能抑制血小板活化和聚集，從而明顯延長移植物存活[32]。與野生型相比，CD39轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細胞在人體血液的凝血時間較長[33]。在小鼠到大鼠心臟異種移植模型中CD39轉(zhuǎn)基因小鼠具有較強的抗血栓形成的能力[34]。隨后的活組織檢查發(fā)現(xiàn)在肝臟細胞內(nèi)存無功能的血小板，表明通過轉(zhuǎn)吞胞作用血管內(nèi)皮細胞將血小板轉(zhuǎn)移到了肝細胞中。這一過程似乎與抗體介導和/或補體活化無關(guān)，因為系統(tǒng)中沒有找到它們存在的證據(jù)。實驗表明豬的凝集素受體和血小板糖蛋白之間存在異常的相互作用，而確切的機制尚不清楚[35]。最新的研究提示，豬細胞對豬血小板無聚集或吞噬作用。然而，GTKO豬肝細胞、肝血竇和豬主動脈內(nèi)皮細胞均能誘導狒狒的血小板聚集。值得一提的是，豬肝竇內(nèi)皮細胞能有效地吞噬狒狒血小板，而豬主動脈內(nèi)皮細胞和豬肝細胞對狒狒的血小板計數(shù)的影響最小[36]。

3 總結(jié)

器官移植領(lǐng)域一個嚴峻的形勢是合適的供體的短缺。GTKO豬的成功開創(chuàng)了異種器官移植的新局面。但是，目前限制異種移植發(fā)展的重要原因就是凝血功能障礙。就其發(fā)生機制尚不能完全明確，因此對凝血功能障礙的機制的研究應該更加重視。

總結(jié)國內(nèi)外的研究我們可以認為，凝血功能障礙涉及到諸多方面，血小板的活化與集聚是這個復雜過程的一個環(huán)節(jié)，但是十分重要。血小板活化與集聚的相關(guān)機制我們尚不完全清楚，因此有必要對血小板進行更加詳細的研究。

未來克服異種移植領(lǐng)域的難題，一方面要加強基礎(chǔ)研究，把凝血功能障礙的原因及機制研究得更加透徹，另一方面要加緊GTKO豬基礎(chǔ)上的新型基因改良豬的研究。以基因改良為根本，加強藥物學手段來干預異種排斥反應也是重要途徑。

[1]Kolber Simonds D，Lai L，Watt SR，et al.Production of alpha-1，3-galactosyltransferase null pigs by means of nuclear transfer with fibroblasts bearing loss of heterozygositymutations[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（19）：7335-7340.

[2]Cooper DK，Dorling A，Pierson RN 3rd，et al.Alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout pigs for xenotransplantation：Where do we go from here?[J].Transplantation，2007，84（9）：1212-1213.

[3]Hayato Iwase，Burcin Ekser，Hao Zhou，et al.Platelet aggregation in humans and nohuman primates：Relevance to xenotransplantation[J].Xenotransplantation，2012，19（4）：233-243.

[4]Peter J，Cowan1，Simon C，et al.Controlling coagulation dysregulation in xenotransplantation[J].Curr Opin Organ Transplant，2011，16（2）：214-221.

[5]Shimizu A，Yamada K，Yamamoto S，et al.Thromboticmicroangiopathic glomerulopathy in human decay accelerating factorl transgenic swine_to_baboon kidney xenografts[J]. JAm Soc Nephrol，2005，16（9）：2732-2745.

[6]Ekser B，Long C，Echeverri GJ，et al.Impact of thrombocytopenia on survival of baboons with genetically modified pig liver transplants：Clinical relevance[J].Am JTransplant，2010，10（2）：273-285.

[7]Burlak C，Paris LL，Chihara RK，et al.The fate of human platelets perfused through the pig liver：Implicationsxenotransplantation[J].Xenotransplantation，2010，17（5）：350-361.

[8]Weiss HJ，Turitto VT，Baumgartner HR.Effect of shear rate on platelet interaction with subendothelium in citrated and native blood：I.Shear rate-dependent decrease of adhesion in von Willebrand's disease and the Bernard-Soulier syndrome[J].JLab Clin Med，1978，92（5）：750-764.

[9]Plow EF，D'Souza SE，Ginsberg MH.Consequences of the interaction of platelet membrane glycoprotein GPIIb-IIIa（alpha IIb beta 3）and its ligands[J].JLab Clin Med，1992，120（2）：198-204.

[10]Shattil SJ，Cunningham M，Hoxie JA.Detection of activated platelets in whole blood using activation-dependentmonoclonal antibodies and flow cytometry[J].Blood，1987，70（1）：307-315.

[11]Dorsam RT，Kunapuli SP.Central role of the P2Y12 receptor in platelet activation[J].JClin Invest，2004，113（3）：340-345.

[12]Khalpey Z，Yuen AH，Kalsi KK，et al.Loss of ecto-5'nucleotidase from porcine endothelial cells after exposure to human blood：Implications for xenotransplantation[J]. Biochim Biophys Acta，2005，1741（1-2）：191-198.

[13]Pareti FI，Mazzucato M，Bottini E，et al.Interaction of porcine von Willebrand factor with the platelet glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex[J].Br JHaematol，1992，82（1）：81-86.

[14]Kim YT，Lee HJ，Lee SW，et al.Pre-treatment of porcine pulmonary xenograftwith desmopressin：A novel strategy to attenuate platelet activation and systemic intravascular coagulation in an ex-vivomodel of swine-to-human pulmonary xenotransplantation[J].Xenotransplantation，2008，15（1）：27-35.

[15]Wise RJ，Dorner AJ，Krane M，et al.The role of von Willebrand factor multimers and propeptide cleavage in binding and stabilization of factorⅧ[J].JBiol Chem，1991，266（32）：21948-21955.

[16]Byzova TV，Plow EF.Networking in the hemostatic system.Integrin AObB3 binds prothrombin and influences its activation[J].JBiol Chem，1997，272（43）：27183-27188.

[17]Peerschke EI，Jesty J，Reid KB，et al.The soluble recombinant form of a binding protein/receptor for the globular domain of C1q（gC1qR）enhances blood coagulation[J]. Blood Coagul Fibrinolysis，1998，9（1）：29-37.

[18]Baldwin IIIWM，Pruitt SK，Brauer RB，et al.Complement in organ transplantation.Contributions to inflammation，injury，and rejection[J].Transplantation，1995，59（6）：797-808.

[19]Ghebrehiwet B，Silvestri L，McDevitt C.Identification ofthe Raji cell membrane-derived C1q inhibitor as a receptor for human C1q.Purification and immunochemical characterization[J].JExp Med，1984，160（5）：1375-1389.

[20]Csako G，Suba EA.Free platelet count and size distribution during C1q inhibition of collagen-induced platelet aggregation[J].Thromb Haemost，1987，58（2）：682-685.

[21]Suba EA，Csako G.C1q（c1）receptor on human platelets：Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by C1q（C1）molecules[J].J Immunol，1976，117（1）：304-309.

[22]Jaffe R，Deykin D.Evidence for a structural requirement for the aggregation of platelets by collagen[J].JClin In vest，1974，53（3）：875-883.

[23]Anderson GP，Anderson CL.Signal transduction by the platelet Fc receptor[J].Blood，1990，76（6）：1165-1172.

[24]Appel III JZ，Alwayn IP，Correa LE，et al.Modulation of platelet aggregation in baboons：Implications formixed chimerismin xenotransplantation：II.The effects of cyclophosphamide on pig peripheral blood progenitor cellinduced aggregation[J].Transplantation，2001，72（7）：1306-1310.

[25]Benatuil L，F(xiàn)ernandez AZ，Romano E.Aggregation of human platelets in plasma by porcine blood cells in vitro is probably mediated by thrombin generation[J].Xeno transplantation，2003，10（5）：454-459.

[26]Teplyakov AI，Pryschepova EV，Kruchinsky NG，et al. Cytokines and soluble cell adhesion molecules.Possible markers of inflammatory response in atherosclerosis[J]. Ann NY Acad Sci，2000，902：320-322.

[27]Mulligan MS，Schmid E，Till GO，et al.C5a-dependent up-regulation in vivo of lung vascular P-selectin[J].J Immunol，1997，158（4）：1857-1861.

[28]Bach FH，Robson SC，F(xiàn)erran C，et al.Endothelial cell activation and thromboregulation during xenograft rejection[J].Immunol Rev，1994，141：5-30.

[29]Pearson JD.Endothelial cell function and thrombosis[J]. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol，1999，12（3）：329-341.

[30]Robson SC，Kaczmarek E，Siegel JB，et al.Loss of ATP diphosphohydrolase activity with endothelial cell activation[J].JExp Med，1997，185（1）：153-163.

[31]Khalpey Z，Yuen AH，Kalsi KK，et al.Loss of ecto-5'nucleotidase from porcine endothelial cells after exposure to human blood：Implications for xenotransplantation[J]. Biochim Biophys Acta，2005，1741（1-2）：191-198.

[32]ImaiM，Takigami K，Guckelberger O，et al.Modulation of nucleoside[correction of nucleotide]triphosphate diphosphohydrolase-1（NTPDase-1）cd39 in xenograft rejection[J]. Mol Med，1999，5（11）：743-752.

[33]Koyamada N，Miyatake T，Candinas D，et al.Apyrase administration prolongs discordant xenograft survival[J]. Transplantation，1996，62（12）：1739-1743.

[34]Dwyer KM，Mysore TB，Crikis S，et al.The transgenic expression of human CD39 on murine islets inhibits clotting of human blood[J].Transplantation，2006，82（3）：428-432.

[35]Dwyer KM，Robson SC，Nandurkar HH，et al.Thromboregulatory manifestations in human CD39 transgenic mice and the implications for thrombotic disease and transplantation[J].J Clin Invest，2004，113（10）：1440-1446.

[36]Qiang Peng.Mechanisms of xenogeneic baboon platelet aggregation and phagocytosis by porcine liver sinusoidal endothelial cells[J].PLo SOne，2012，7（10）：472-473.

The mechanism of p latelets aggregation in the coagulation dysfunction of xenograft

SHEN Kefeng1LIU Hong2SHILiuming1
1.The First Clinical Medicine School,ShanxiMedical University，Taiyuan 030000，China；2.General Surgery，the First Hospital of ShanxiMedical University，Taiyuan 030000，China

The successful cultivation ofGTKO-pig has eliminated the problem ofhyperacute rejection（HAR），which is a significant progress in the field of xenograft.However，delayed xenograft rejection（DXR）has become a barrier.The main manifestation of it is coagulation dysfunction，whose pathological features is abnormal coagulation，thrombosis and consumptive coagulopathy.Platelets activation and aggregation play an essential role in development of coagulation disorders and thrombotic microvascular disease between pigs to nonhuman primates xenotransplantation.The aim of this review is to explore themechanisms of aggregation of platelets in delayed xenograft rejection.

Platelets；Aggregation；Coagulation；Xenograft；Mechanism

R392．4；R617

A

1673-9701（2015）36-0157-04

2015-11-05）

△在讀研究生▲