金和平　陳金龍

摘要：為了解湖北省崇陽縣豬偽狂犬病毒的感染狀況，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)來自崇陽縣不同規(guī)模7個(gè)種豬場(chǎng)的126份公豬精液進(jìn)行了豬偽狂犬病毒（PRV）的檢測(cè)，陽性率為0；同時(shí)采取了這7個(gè)已使用豬偽狂犬病病毒gE基因缺失疫苗免疫血清420份，采用了豬偽狂犬病基因缺失鑒別ELISA方法進(jìn)行了血清學(xué)抗體監(jiān)測(cè)，結(jié)果檢出豬偽狂犬gE抗體陽性10份，陽性率為2.37%。結(jié)果表明，崇陽縣豬群中存在豬偽狂犬病野毒感染，但感染率較低，不同豬場(chǎng)感染差異大。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病毒（PRV）；PCR；基因缺失鑒別ELISA；gE抗體

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）11-009-02

偽狂犬?。≒seudorables，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染病，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的豬傳染病之一。該病可引起種豬的不育、妊娠母豬的流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎、仔豬大量死亡等，從而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。我國(guó)自1947年首次報(bào)道以來[2]，已有20多個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）有豬偽狂犬病的發(fā)生，2012年以來，豬偽狂犬病席卷了我國(guó)大江南北，目前，各個(gè)省市都有豬偽狂犬病的相關(guān)報(bào)道。PRV主要通過母豬胎盤和公豬精液垂直傳播，同時(shí)也可水平傳播[3]。偽狂犬病病毒常呈隱性潛伏感染或長(zhǎng)期帶毒的狀態(tài)存在，當(dāng)環(huán)境激變或者被其它應(yīng)激因素激發(fā)，往往可與其他病原體協(xié)同作用引起多種疾病的發(fā)生，從而引起疫病的暴發(fā)[4]。目前規(guī)模豬場(chǎng)普遍采取人工授精技術(shù)，如果公豬健康帶毒或者精液中存在帶毒情況，則很容易通過精液傳播造成疫病的擴(kuò)散與流行。因此，做好種豬場(chǎng)豬偽狂犬病的病原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，及時(shí)清除隱性帶毒豬，凈化豬群至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

公豬精液采自崇陽7個(gè)種豬場(chǎng)，共126份。

豬血清采自7個(gè)已使用gE基因缺失苗至少半年以上的母豬場(chǎng)，隨機(jī)抽樣采血共420份。

SDS、蛋白酶K、苯酚、氯仿、無水乙醇、dNTPs、TaqDNA聚合酶（購(gòu)自TaKaRa公司）、豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（由IDEXX提供）。

主要儀器PCR儀、凝膠成像分析儀、電泳儀、酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 PRV引物設(shè)計(jì) 上游引物：5′-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′；下游引物：5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′。

1.2.2 病毒總DNA 的抽提 取公豬精液500μL，加入50μL的SDS（10%），20μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻，50 ℃水浴2 h，每20 min 搖勻一次。加入500 μL苯酚混勻，靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min；取上清，加入等體積苯酚、氯仿（1：1），冰浴5 min，4℃ 1 2000r/min 離心5 min；取等體積氯仿冰浴5 min，4℃，1 2000 r/min離心5 min；取上清加入2～2.5倍的無水乙醇及1/10體積的3μL/L的NaAc混勻，-20 ℃放置30 min或過夜，同上離心15 min；棄上清，加1 000μL 75%乙醇，洗滌1 次。晾干EP管中的DNA，加入30 μL的雙蒸水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系與條件 PCR 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0μL，上、下游引物（25 pmol/L）各0.5μL，DNA模板5.0μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL，加H2O至25μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)按照豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.2.5 結(jié)果判定

PCR病原檢測(cè)結(jié)果判定PRV陽性對(duì)照出現(xiàn)217 bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)217 bp擴(kuò)增帶為陽性，否則為陰性。

ELISA檢測(cè)結(jié)果判定陰性對(duì)照A650nm的平均值減去陽性對(duì)照A650nm的平均值必須大于或等于0.3，試驗(yàn)方能有效。如果S/N值（樣品/陰性對(duì)照比率）低于或等于0.60，樣品應(yīng)判定為PRV gE抗體陽性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，樣品應(yīng)重測(cè)。如果試驗(yàn)結(jié)果不變，間隔一定時(shí)間后重新采樣、檢測(cè)。如果S/N值大于0.70，樣品應(yīng)判定為PRV gE抗體陰性。

2 結(jié)果與分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)在陽性對(duì)照有217 bp條帶出現(xiàn)，而陰性對(duì)照無任何條帶，表明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果126份公豬精液PRV的PCR擴(kuò)增結(jié)果均未出現(xiàn)相應(yīng)片段，表明無PRV感染或帶毒現(xiàn)象存在。

PRV野毒感染的ELISA檢測(cè)結(jié)果對(duì)7個(gè)母豬場(chǎng)的420份送檢血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出血清陽性10份，陽性率為2.37%（表1）。

3 小結(jié)與討論

（1）在本次部分種豬場(chǎng)偽狂犬病帶毒感染情況調(diào)查中，PCR檢測(cè)公豬精液的陽性率為0，說明母豬場(chǎng)對(duì)于公豬的偽狂犬病凈化相當(dāng)重視，取得了一定的成效；豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)母豬豬偽狂犬病野毒感染陽性率為2.37%，對(duì)于基礎(chǔ)母豬群的偽狂犬凈化還需加強(qiáng)。

（2）通過豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，7個(gè)母豬場(chǎng)豬偽狂犬病野毒感染情況，各豬場(chǎng)之間的陽性感染率存在一定差別，有3個(gè)豬場(chǎng)存在豬偽狂犬病的感染；由于取樣數(shù)量有限，不能完全代表我縣豬偽狂犬病野毒感染水平，但說明了我縣豬場(chǎng)存在不同程度的豬偽狂犬病毒感染，對(duì)于感染率高的豬場(chǎng)要及時(shí)進(jìn)行全面的定期監(jiān)測(cè)普查，及時(shí)清除野毒感染豬，使豬場(chǎng)豬群逐步得到凈化。

（3）豬偽狂犬病的檢測(cè)方法較多，病原學(xué)檢測(cè)包括病毒的分離鑒定、PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)等；血清學(xué)檢測(cè)主要包括ELISA、乳膠凝集試驗(yàn)等。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法常不能區(qū)分免疫抗體與感染抗體，有很大的局限性；而PCR診斷技術(shù)與豬偽狂犬病基因缺失鑒別ELISA方法都具有敏感性高，能夠特異性地檢測(cè)出野毒感染并且快速簡(jiǎn)便，在病原檢測(cè)和感染抗體監(jiān)測(cè)工作中具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。為豬場(chǎng)清除健康帶毒豬，控制與凈化偽狂犬病有著重要作用。

（4）豬場(chǎng)偽狂犬病的控制與凈化工作是一項(xiàng)長(zhǎng)期的系統(tǒng)工作，涉及到疫苗免疫、衛(wèi)生消毒和飼養(yǎng)管理等各個(gè)方面。對(duì)于種豬場(chǎng)來說，應(yīng)免疫和監(jiān)測(cè)并重。因?yàn)閹Ф痉N豬就如散毒機(jī)器，危害性極大，不但會(huì)造成本場(chǎng)偽狂犬病的流行，還會(huì)造成一系列連鎖反應(yīng)，是導(dǎo)致豬場(chǎng)偽狂犬病暴發(fā)的直接原因。因此，做好種豬場(chǎng)偽狂犬病的病原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，及時(shí)清除帶毒種豬，凈化豬群至關(guān)重要。同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)生物安全管理措施，推行封閉式管理、仔豬早期隔離斷奶、小單元全進(jìn)全出、二期保育等飼養(yǎng)模式，確保控制與凈化效果。

參考文獻(xiàn)：

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