吳玉娥，李航，陳梅玲，龔寶勇，張鈺，黃韌*

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663;2.廣東藥學院，廣州 510224)

動物模型是研究感染性疾病發(fā)病機制的主要工具［1，2］。因其可在整體動物上模擬病原和宿主(人)間的復雜作用，并且可以避開倫理問題直接研究病原對動物的組織或因子的作用，動物模型具有體外試驗不可比擬的優(yōu)勢。近年來，臨床上侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率和死亡率不斷上升，相對應出現(xiàn)了許多真菌感染的動物模型研究。根據(jù)不同的研究目的，研究者們通常會選擇不同的動物種類和感染途徑來建立動物模型，但目前最為常用的還是靜脈感染小鼠模型［3］。本實驗室長期進行念珠菌感染動物模型研究，在系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立上積累了豐富的經(jīng)驗。我們的建模方法穩(wěn)定，具可重復性，已成功應用于念珠菌毒力研究及抗真菌藥物篩選［4］。本文主要從菌株制備、靜脈接種、劑量選擇及模型評價等方面對模型建立的每個關鍵步驟進行細節(jié)描述，希望為其他科研工作者提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株

白色念珠菌(C.albicans)SC5314、CaR、CaS、CaDel、CaCoM-A、CaCoM-B 及非白念珠菌(C.parapsilosis)，均為中國科學院微生物研究所張立新博士饋贈。

1.2 實驗小鼠

SPF 級ICR 小鼠，體重22 ～26 g，4 ～6 周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】。動物實驗在負壓感染動物實驗室進行【SYXK(粵)2012-0122】，動物實驗開展經(jīng)廣東省實驗動物監(jiān)測所動物使用和管理委員會審批。

1.3 免疫抑制

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞制藥廠)腹腔注射，1 次/24 h，共注射3 次，注射劑量為100 mg/kg，第4 天進行念珠菌接種。

1.4 菌株制備

1.4.1 菌體培養(yǎng)

(1)從－80℃冰箱取出菌液，解凍。使用滅菌接種環(huán)把解凍后的菌液接種到固體YEPD 平板上，30℃培養(yǎng)26h，觀察菌體有無生長，是否污染。

(2)確定無污染后，從培養(yǎng)皿上挑選單個菌落用無菌接種環(huán)接種到液體YEPD［2］中，30℃搖床培養(yǎng)16 h，200 r/min。

(3)觀察液體YEPD 渾濁度，渾濁為接種成功。

(4)菌落形態(tài)觀察:取1 滴乳酚甲苯胺藍染色液加入1 滴菌液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡鏡檢。

1.4.2 分裝保存

(1)在超凈工作臺上將接菌成功的液體YEPD倒入已滅菌的45 mL 離心管中，離心(3000 r/min，10 min)。

(2)丟棄上層液體，加入適量滅菌生理鹽水，吹打混勻，離心(3000 r/min，10 min)。重復二次。

(3)丟棄上層液體，加入適量滅菌生理鹽水，吹打混勻。使用20%無菌甘油-生理鹽水配置成一定體積，取100 μL 于包被板中，每個樣品至少加兩孔。用酶標儀測其A 值，使其A 值達到0.35 ～0.4［此時菌液濃度為(3 ～5)×107CFU/mL］，分裝置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 接菌前濃度調整

于－80℃冰箱內取出備用菌液，解凍后置于36℃培養(yǎng)箱中復蘇1 h，按照預計接菌濃度對菌液進行梯度稀釋。例如，預計接種濃度為(3.0 ～5.0)×105cells/mL，則將菌液稀釋100 倍。留取1 mL 稀釋后的菌液，用于確定實際接菌濃度。

1.4.4 確定實際菌液濃度

菌液經(jīng)10 倍梯度稀釋，選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.2 mL 加入固體無菌YEPD 培養(yǎng)基，使用滅菌的玻璃涂棒涂布均勻。30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，計算菌落數(shù)目，菌落數(shù)在30 ～300 之間的稀釋度有效。按下面公式計算出菌液的含菌數(shù):每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度三個重復平皿菌落平均數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 5。

1.4.5 菌株保存穩(wěn)定性測試

按照1.4.3 和1.4.4 所述，對－80℃冰箱保存的菌株(以CaR，CaS，CaDel，CaCoM-A 和CaCoM-B為例)定期取出進行穩(wěn)定性測試。

1.5 靜脈接種

采用1 mL 注射器，每只小鼠經(jīng)尾靜脈接種酵母型菌進行感染。接種當天秤量每只小鼠體重，根據(jù)體重確定每只小鼠的接種劑量，常用接種劑量為0.2 mL 菌液/20 g 小鼠。

1.6 模型評價指標

生存情況:感染動物以死亡為評價指標。接種后，每天觀察小鼠兩次，連續(xù)觀察14 d。當發(fā)現(xiàn)下列情況中任何兩項時，安樂死小鼠，以減少對其的疼痛和應激。①弓背、被毛松亂;②體重下降超過起始體重的20%;③體溫降低，觸之冰冷;④活動明顯減少;⑤不能進食;⑥斜頸或原地打轉。在進行生存觀察時，將安樂死小鼠死亡時間記錄到下一天。一般采用生存曲線對感染小鼠的生存情況進行描述，采用Log-rank test 統(tǒng)計方法對生存曲線進行比較分析，P ＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義［5］。

靶器官載菌量檢測:在染菌后的第2 天、4 天和6 天，每組至少取3 只小鼠，采集心、肝、脾、肺、腎和腦，稱重后加入1 mL 無菌生理鹽水研磨成勻漿液，進行10 倍梯度稀釋，選擇適當?shù)南♂対舛龋?.2 mL接種于YPD 固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，進行菌落計數(shù)。菌落數(shù)在30 ～300 之間的勻漿液稀釋度有效。計算組織的載菌量log CFU/g。CFU/g=3 個培養(yǎng)基的CFU 的平均數(shù)×5×勻漿液體積(mL)× 稀釋倍數(shù) ÷ 組織重量(g)

病理組織學檢測:取小鼠主要靶器官心、肝、脾、肺、腎和腦，中性福爾馬林溶液固定后，進行常規(guī)病理切片，行HE 和PAS 染色。

2 結果

2.1 菌體形態(tài)學觀察結果

以CP 菌為例，從－80℃冰箱取出的菌種經(jīng)培養(yǎng)，鏡檢顯示，CP 菌的形態(tài)處于酵母型，未見假菌絲的出現(xiàn)(圖1)。經(jīng)臺盼藍染色鏡檢，顯示90%的菌體為活菌體。

圖1 C.parapsilosis 形態(tài)觀察(酵母型菌體形態(tài))Fig.1 Morphologic observation of the C.parapsilosis (yeast type)

2.2 菌株保存穩(wěn)定性測試結果

經(jīng)過7 個月的測試，CaR、CaS、CaDel、CaCoM-A和CaCoM-B 5 個菌株的活菌數(shù)一直保持穩(wěn)定狀態(tài)，見圖2 所示。

圖2 菌株保存穩(wěn)定性測試結果Fig.2 Results of strains preservation stability test

2.3 免疫抑制結果

正常小鼠外周血白細胞總數(shù)約為(7 ～8)×109個/L，小鼠注射CY 后第1 天開始，外周血白細胞總數(shù)出現(xiàn)明顯下降趨勢，注射后第4 天降至最低點約1.6 ×109個/L。第5 天開始小鼠外周血白細胞總數(shù)開始回升，至注射后第8 ～12 天，基本恢復到正常水平，見圖1。根據(jù)實驗結果，我們選擇免疫抑制后白細胞計數(shù)最低點(CY 給藥后第4 天)進行念珠菌接種。

2.4 生存情況

圖3 小鼠接種CY 后外周血白細胞總數(shù)變化Fig.3 Total leukocyte counts in the cyclophosphamide-treated mice

采用生存曲線對感染小鼠的生存情況進行描述和分析。選擇相同接種劑量(1.0 ×105CFU/mL)，CaR、CaDel，CaCoM-A 和CaCoM-B 四個菌株引起小鼠死亡情況相近，中位生存間分別是7、8、7 d 和6 d。采用log-rank test 統(tǒng)計方法對生存曲線進行比較分析，各組間無統(tǒng)計學差異。該結果說明在相同接種劑量下，4 個菌株對小鼠的毒力無差異。見圖4所示。

圖4 小鼠接種CaR、CaDel、CaCOM-A 和CaCOMB 四個菌株后的生存情況Fig.4 Survival curves of the mice after inoculation of CaR，CaDel，CaCOM-A and CaCOM-B strain Candida

2.5 組織載菌量

在系統(tǒng)性真菌感染小鼠模型，腎臟是真菌感染的主要靶器官。以SC5314 為例，接種劑量為1.0 ×104CFU/mL，小鼠感染后第2 ～4 天組織載菌量達高峰，以腎臟載菌量最高，可達到106～108CFU/g，其他臟器如肝臟、腦、脾臟和肺臟等組織載菌量一般在104CFU/g，隨著感染時間延后，各組織載菌量逐漸下降，見圖5 所示。

2.6 組織病理變化

圖5 小鼠接種SC5314 后各臟器組織載菌量變化Fig.5 Dynamic changes of tissue fungal burdens after SC5314 inoculation in the mice

病理組織學觀察顯示以腎臟為靶器官，多器官彌散性真菌感染的典型病理組織學改變。除腎臟外，心臟、腦、肺、肝和脾亦可見真菌浸潤病灶，見圖6 所示。

3 討論

念珠菌形態(tài)學上的雙向性與其毒力密切相關。在念珠菌彌散性感染小鼠模型建立過程中，菌體形態(tài)是重要的質控要素。白色念珠菌和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)均屬于雙向型真菌，在不同營養(yǎng)因素、化學因素或其他物理因素的作用下，可以由一種形態(tài)(酵母相)轉變成另一種形態(tài)(菌絲相)，當念珠菌從酵母相轉變?yōu)榫z相后，其毒力明顯增強［6］。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，當給予免疫抑制小鼠接種1.0×106個/mL 菌絲型C.parapsilosis 菌，可造成小鼠48 h 內全部死亡;當給予免疫抑制小鼠接種相同劑量的酵母型菌，則小鼠全部死亡時間推遲為8 天。菌絲型菌毒力明顯增強，能使動物快速死亡，不適合建立動物模型。因此，嚴格進行菌體培養(yǎng)條件的質控，使注入實驗動物體內的菌體為處于對數(shù)生長期的酵母型菌，是模型成功的關鍵。

真菌感染的發(fā)生是病原體、宿主及環(huán)境間相互作用的結果，念珠菌侵入人體后是否發(fā)病不僅取決于病原體的數(shù)量、毒力及入侵途徑，也取決于宿主自身的免疫防御能力及各種外界因素的綜合影響。臨床上彌散性念珠菌病患者均處于不同程度的免疫缺陷狀態(tài)［7，8］。因此，為了模擬臨床致病條件，在念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立過程中首先要實現(xiàn)小鼠的免疫抑制。實驗用形成免疫抑制的方法有多種，主要有抗腫瘤藥阿糖胞苷，免疫抑制劑及激素可的松等。我們采用給小鼠注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CY)，這種免疫抑制方式表現(xiàn)為白細胞數(shù)量下降，特別是嗜中性粒細胞的下降，不僅有利于念珠菌入侵感染，還有效地模擬了臨床上較多見的嗜中性粒細胞下降引起的彌散性真菌病的病例。

圖6 小鼠接種C.parapsilosis 后組織器官病理改變Fig.6 Histological changes in the organs of mice infected with C.parapsilosis

菌株制備過程的質量控制是影響模型穩(wěn)定性的關鍵環(huán)節(jié)。只有保證每批次實驗小鼠接種的菌液濃度一致，才能保證模型的可重復性。本實驗室采用一次性制備足夠量的菌液，確定一個較高的菌液濃度(例如5.0 ×107CFU/mL)后進行分裝，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ院竺看螌嶒炄〕? 支菌液，解凍后置于30℃培養(yǎng)箱中復蘇1 h，按照預計接種濃度對菌液進行梯度稀釋。這樣就可以保證每批次開展實驗使用相同濃度的菌液。本保存方法經(jīng)過半年的測試，保存的活菌數(shù)一直保持穩(wěn)定狀態(tài)。

靜脈接種亦是影響模型重復性和穩(wěn)定性的重要因素之一。真菌菌體較大，具有一定的重量，菌液放置一定時間后，菌體會自然下落并在容器下方沉積成叢。因此接菌時，每次抽取菌液前都要將菌液搖勻(至少10 s)，這樣才能保證每次吸入的菌液濃度一致。通常采用1 mL 注射器，經(jīng)小鼠尾靜脈接種菌液進行感染，常用接種劑量為0.2 mL。當小鼠體重相差較大時，需要根據(jù)體重確定每只小鼠的接種劑量。靜脈注射前可采用光照或涂擦酒精的方法使小鼠尾部血管擴張，以方便進針，注射完成后，按壓注射位點約30 s，防止菌液倒流。注射時，如因針頭進入位置不當，偏離血管，則推注時阻力較大，并且出現(xiàn)注射部位皮膚變白，此時應立即停止注射，拔出針頭，重新調整注射位置注射，一定要確保菌液完全接種入靜脈。

系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立過程中，除了需要考慮上述影響因素外，還要考慮感染菌株的致病性。具體實驗中，由于選擇的念珠菌種類不同，毒力不同，注射的菌量也不同。例如同樣是利用念珠菌進行毒力研究，選擇白色念珠菌CaR 和近平滑念珠菌CP 分別接種小鼠，要求接種后2 周內小鼠死亡率達90%以上，則兩個菌株的實際接種劑量分別為1 ×105CFU/mL 和4.5 ×105CFU/mL，兩者相比較，CP 菌的毒力較低，達到相同實驗目的需要的接種劑量要高。而感染菌株為SC5314 時，1 × 105CFU/mL 接菌劑量可使小鼠在接種后5 d 內全部死亡。因此，針對不同菌株我們都需要預先摸索不同接種劑量對動物的影響，并根據(jù)我們的實驗目的來選擇合適的接種劑量。

質量控制是決定動物模型成功建立的根本所在，忽略任何一個環(huán)節(jié)都會影響模型的穩(wěn)定性。本文從免疫抑制、菌株制備、靜脈接種、劑量選擇及模型評價等多個方面對系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型建立過程進行了逐一描述，指出影響模型質量的關鍵環(huán)節(jié)及質控方法。系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠模型主要表現(xiàn)以下特點:感染動物可出現(xiàn)死亡;靜脈接種后短期內腎臟、心臟、腦及肺臟等多個臟器出現(xiàn)載菌量高峰，隨后下降;病理組織學顯示腎臟為靶器官，多器官彌散性真菌性感染的典型病理組織學改變。該模型可應用于系統(tǒng)性念珠菌感染的致病機理，免疫防御及抗真菌藥物篩選等研究領域。

［1］Szabo EK，MacCallum DM.The contribution of mouse models to our understanding of systemic candidiasis［J］.FEMS Microbiol Letters，2011，320(1):1 －8.

［2］Repentigny LD.Animal models in the analysis of Candida hostpathogen interactions［J］.Microbiology，2004，7(4):324 －329.

［3］MacCallum DM.Hosting infection:experimental models to assay candida virulence［J］.Int J Microbiol，2012，Volume 2012，Article ID 363764，12 pages.

［4］Zhang LX，Yan KZ，Zhang Y，et al.High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment of fungal infections［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(11):4606 －4611.

［5］Salas V，Pastor FJ，Calvo E，et al.Anidulafungin in treatment of experimental invasive infection by Candida parapsilosis:in vitro activity，(1 →3)-β-d-glucan and Mannan serum levels，histopathological findings，and in vivo efficacy［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55 (11):4985 －4989.

［6］van Asbeck EC，Clemons KV，Stevens DA.Candida parapsilosis:a review of its epidemiology，pathogenesis，clinical aspects，typing and antimicrobial susceptibility［J］.Crit Rev Microbiol，2009，35(4):283 －309.

［7］Orasch C，Marchetti O，Garbino J，et al.Candida species distribution and antifungal susceptibility testing according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and new vs.old Clinical and Laboratory Standards Institute clinical breakpoints:a 6-year prospective candidaemia survey from the fungal infection network of Switzerland ［J］.Clin Microbiol Infect，2014，20(7):698 －705.

［8］Ha JF，Italiano CM，Heath CH，et al.Candidemia and invasive candidiasis:a review of the literature for the burns surgeon［J］.Burns，2011，37(2):181 －195.