趙建元，丁寄葳，米澤云，周金明，魏濤，岑山

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HIV-1初始傳播病毒基因遺傳變異對誘導(dǎo)G2期阻滯及細(xì)胞凋亡的影響

趙建元1,2，丁寄葳2，米澤云2，周金明2，魏濤1，岑山2

1. 北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100192； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050

人免疫缺陷病毒(HIV-1)急性感染過程中，病毒的遺傳多樣性顯著減少，往往只有一株或幾株病毒可以建立有效感染，這種病毒被稱為初始傳播病毒(Transmitted/Founder virus)。病毒蛋白R(Vpr)是HIV-1的輔助蛋白之一，在病毒復(fù)制過程中起重要作用。研究初始傳播病毒基因遺傳變異與生物學(xué)特征對于闡明病毒建立感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重要意義。文章利用流式細(xì)胞術(shù)分析了C亞型HIV-1初始傳播病毒株與慢性感染株MJ4的 Vpr蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的能力。結(jié)果顯示，初始傳播病毒ZM246和ZM247的Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的能力顯著高于慢性感染株MJ4 Vpr。氨基酸序列分析表明，初始傳播病毒Vpr在第77、85和94位上存在高頻突變。研究結(jié)果提示初始傳播病毒可能在病毒感染早期，通過基因的遺傳突變，提升病毒誘導(dǎo)細(xì)胞停滯G2期和細(xì)胞凋亡的能力，進(jìn)而促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和傳播。

人免疫缺陷病毒；初始傳播病毒；病毒蛋白R()；細(xì)胞G2期阻滯；細(xì)胞凋亡

病毒蛋白R (Viral protein R, Vpr)是人免疫缺陷病毒(HIV-1)基因編碼的一個輔助蛋白，由96個氨基酸組成，分子量約14 kDa[1]。Vpr的三級結(jié)構(gòu)含有3個兩親性的α螺旋(17~33，38~50及56~77 aa)，這3個α螺旋圍繞一個疏水核心，參與了Vpr和各種細(xì)胞蛋白能夠相互作用[2,3]。寡聚化Vpr是其發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[4]。在Vpr C端的第73~96位氨基酸之間含有6個精氨酸，該區(qū)域與富含精氨酸蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)(Protein transduction domains, PTD)相似，決定了Vpr跨細(xì)胞膜脂雙層的能力[5~7]。

Vpr在HIV-1復(fù)制過程中執(zhí)行著多種生物學(xué)功能，而Vpr功能的喪失將會導(dǎo)致HIV-1感染者疾病進(jìn)程減慢[8]。Vpr通過與HIV-1的Gag p6相互作用被包裝進(jìn)入病毒顆粒，進(jìn)而維持病毒逆轉(zhuǎn)錄過程的高保真性和促進(jìn)前整合復(fù)合物的入核等[9,10]。此外，Vpr可以導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2期[11]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，影響宿主和HIV-1基因表達(dá)等[13,14]，是HIV-1發(fā)病機(jī)制和T細(xì)胞感染所必須的蛋白質(zhì)[2]。

在HIV-1基因組中是高度保守的序列之一，不同毒株間的氨基酸序列相似性高達(dá)87%，且其C端都在誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期停滯及細(xì)胞調(diào)亡等方面執(zhí)行重要作用[5]。HIV-1 Vpr的72~83氨基酸是線粒體毒性區(qū)域，可導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，而73、77及80位氨基酸突變可使該活性喪失[2]。Deniaud等[15]研究也顯示，84~96及73、77、80和85位氨基酸是Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2停滯的關(guān)鍵性氨基酸。在HIV-1長期無進(jìn)展者(LTNP)中約80% Vpr蛋白存在R77Q變異[16]。上述Vpr變異株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯低于野生株，其機(jī)制可能與線粒體外膜損傷、激活caspase 9前體及caspase 3相關(guān)[17]。

在HIV-1粘膜傳播過程中，病毒的遺傳多樣性是顯著減少的，表現(xiàn)出嚴(yán)重的“遺傳瓶頸”效應(yīng)和有限的早期進(jìn)化。研究發(fā)現(xiàn)，只有少數(shù)的一株或幾株HIV-1病毒可以建立有效感染，這種病毒被稱為初始傳播病毒(Transmitted/Founder virus)[18]。研究初始傳播病毒的生物學(xué)和早期進(jìn)化特征，有助于闡明HIV-1建立感染的關(guān)鍵因素。目前，對初始傳播病毒的研究多側(cè)重于包膜蛋白的進(jìn)化特征[19,20]，而在基因變異及其功能變化方面鮮有報道。本研究分析了初始傳播病毒Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G期阻滯和細(xì)胞凋亡的能力，發(fā)現(xiàn)初始傳播病毒Vpr的活性明顯高于同一亞型的慢性感染株MJ4。氨基酸序列分析表明，初始傳播病毒Vpr在第77、85和94位上存在高頻突變。本研究為闡明初始傳播病毒基因變異和進(jìn)化特征在HIV-1感染過程中的生物學(xué)功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pZM246F-10和pZM247Fv1為編碼C亞型HIV-1初始傳播病毒基因組的質(zhì)粒，由NIH AIDS Reagent Program惠贈。人胚腎上皮細(xì)胞293T為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸序列比對及突變位點(diǎn)分析

根據(jù)NCBI報道的基因序列，選取C亞型HIV-1初始傳播病毒株和慢性感染株(MJ4)，利用DNA Star基因分析軟件對氨基酸序列進(jìn)行對比。

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以初始傳播病毒株ZM246F-10和ZM247Fv1的基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增基因，所用的引物如表1所示。慢性感染株MJ4的基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。將所得到的基因片段分別連接到pcDNA4TM/TO/myc-His B表達(dá)載體(Invitrogen公司)，得到帶有c-myc-標(biāo)簽的Vpr表達(dá)質(zhì)粒pZM246-Vpr、pZM247FV1-Vpr和pMJ4-Vpr，并通過測序驗(yàn)證。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中。6孔板每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×105個，培養(yǎng)24 h 后，采用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofecta-mine 2000(Invitrogen公司)，按產(chǎn)品說明書方法轉(zhuǎn)染相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。

表1 Vpr基因擴(kuò)增引物序列

1.2.4 免疫蛋白印記(Western blot)檢測Vpr蛋白的表達(dá)

將ZM246-Vpr(400 ng和800 ng)、ZM247Fv1- Vpr(600 ng和1200 ng)及MJ4-Vpr(300 ng和600 ng)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h收獲細(xì)胞。加入RIPA冰上裂解30 min，每10 min 渦旋振蕩一次。然后，加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液，得到細(xì)胞總蛋白樣品。樣品經(jīng)聚丙烯酰胺蛋白電泳分離和轉(zhuǎn)膜后，先后加入一抗Anti-c-myc(美國Sigma公司，1:3000)或β-actin(英國Abcam公司，1:5000)，二抗山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1:5000)，進(jìn)行免疫蛋白印記(Western blot)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

用PBS洗滌收集轉(zhuǎn)染后60 h的細(xì)胞，重懸于預(yù)冷的70%乙醇中于4℃固定24 h以上，加入終濃度為100 μg/mL的RNaseA于37℃消化30 min，將細(xì)胞重懸于含50 μg/mL PI(溴化丙錠)的PBS中，常溫避光孵育1 h后，利用流式細(xì)胞儀(Guava easyCyte 6HT)進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析。

1.2.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡

用PBS洗滌收集轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞，重懸于含1% FBS(胎牛血清)預(yù)冷的PBS中，取100 μL樣品于1.5 mL EP管，加入100 μL Guava Nexin Reagent，常溫避光孵育20 min后，利用流式細(xì)胞儀(Guava easyCyte 6HT) 進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始傳播病毒Vpr氨基酸序列比對及突變位點(diǎn)分析

首先根據(jù)NCBI報道的基因序列，利用DNA Star基因分析軟件，將C亞型HIV-1初始傳播病毒Vpr與慢性感染株MJ4 Vpr的氨基酸序列進(jìn)行了對比，結(jié)果如圖1A所示。初始傳播病毒ZM246毒株的Vpr與MJ4的Vpr氨基酸相似度為89.6%，共發(fā)現(xiàn)T19A、I22L、P36R、Y45H、E48D、T59V、Q77H、Q85R、S94N和P96S共10個點(diǎn)突變；而ZM247Fv1-Vpr與MJ4-Vpr氨基酸相似度為88.5%，其中包括I22L、P36R、P37V、E48D、T55A、T59A、I61V、L84I、Q85P、S94G和P96S共計(jì)11個點(diǎn)突變。

隨后，本研究進(jìn)一步對HIV-1 C亞型共1287株初始傳播病毒的Vpr氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，92.3%的慢性感染株Vpr第77位均為Q，而約37%的初始傳播病毒毒株發(fā)生了Q77H的變異；此外，部分初始傳播病毒第85位發(fā)生了R85P和R85Q的變異；約35.8%的初始傳播病毒第94位發(fā)生了S94N的變異(圖1B)。當(dāng)對本實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)中常用的初始傳播病毒ZM246、ZM247和ZM249單獨(dú)進(jìn)行分析時，也得到了類似的結(jié)果。鑒于Vpr的C末端，特別是R77、R80等氨基酸殘基在誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期停滯及細(xì)胞-凋亡上的重要作用，該序列分析結(jié)果提示初始傳播病毒的Vpr的生物學(xué)活性可能發(fā)生了改變。

2.2 初始傳播病毒vpr表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了進(jìn)一步明確初始傳播病毒Vpr調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的活性，本研究構(gòu)建了含c-myc標(biāo)簽的ZM246-Vpr、ZM247Fv1-Vpr及MJ4-Vpr表達(dá)質(zhì)粒，隨后將上述3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并利用Western blot對Vpr表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，上述3種含c-myc標(biāo)簽的Vpr均可表達(dá)(圖2)。

2.3 初始傳播病毒vpr對細(xì)胞周期的影響

本研究利用流式細(xì)胞術(shù)，對瞬時表達(dá)不同水平(高劑量和低劑量)Vpr的293T細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)退奖磉_(dá)Vpr時，初始傳播病毒ZM246和ZM247Fv1的Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2阻滯的能力均明顯高于慢性感染病毒MJ4的Vpr(分別為0.0317和0.043)；但高水平表達(dá)時三者誘導(dǎo)細(xì)胞G2阻滯的能力無顯著性差異(分別為0.1168和0.1040)(圖3，表2)。研究結(jié)果提示初始傳播病毒Vpr的基因變異將提高其誘導(dǎo)細(xì)胞G2阻滯的能力。

圖1 初始傳播病毒Vpr及MJ4 Vpr氨基酸序列比對及突變位點(diǎn)分析

A：初始傳播病毒Vpr氨基酸序列比對結(jié)果(其中紅色標(biāo)出的部分為實(shí)驗(yàn)時所用的3株毒株，其余8株為其他初始傳播病毒毒株)；B：初始傳播病毒Vpr突變位點(diǎn)分析。

圖2 Western blot檢測Vpr蛋白的表達(dá)

將慢性感染株MJ4 Vpr及初始傳播病毒Vpr的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(5×106/孔)，48 h收獲細(xì)胞并進(jìn)行Western blot檢測。

2.4 初始傳播病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用

本文利用流式細(xì)胞術(shù)，對瞬時表達(dá)不同水平(高劑量和低劑量)Vpr的293T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行了測定。數(shù)據(jù)顯示：ZM246-Vpr、ZM247Fv1-Vpr與MJ4-Vpr相比，在低濃度時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力均顯著提高(=0.01和=0.0326)；高濃度時，ZM247Fv1-Vpr與MJ4-Vpr的活性顯現(xiàn)出顯著性差異(=0.0151)，而ZM246-Vpr與MJ4-Vpr基本相當(dāng)(=0.0967)(圖4，表3)。

圖3 初始傳播病毒Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯

A：慢性感染株MJ4-Vpr及初始傳播病毒Vpr分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析；B：慢性感染株MJ4 Vpr及初始傳播病毒 Vpr誘導(dǎo)293T細(xì)胞G2期阻滯相對定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

表2 Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯的定量化結(jié)果

3 討 論

在HIV-1急性感染期，病毒在傳播過程中存在嚴(yán)重的“遺傳瓶頸”效應(yīng)和有限的早期進(jìn)化。了解初始傳播病毒的早期進(jìn)化和生物學(xué)特征，有助于進(jìn)一步闡明HIV-1在新宿主內(nèi)成功復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為有效阻斷新感染的防治策略發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。本研究首先對C亞型HIV-1初始傳播病毒株和慢性感染株MJ4的 Vpr氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)初始傳播病毒在影響其誘導(dǎo)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡能力的一些關(guān)鍵氨基酸均存在突變。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明初始傳播病毒Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的能力明顯高于慢性感染株MJ4 Vpr。上述結(jié)果提示，初始傳播病毒可能通過其早期進(jìn)化，提高Vpr的生物學(xué)活性，誘導(dǎo)更多的感染細(xì)胞停留在G2期，導(dǎo)致大量的CD4T細(xì)胞凋亡，為病毒傳播創(chuàng)造有利條件。

早期的研究結(jié)果顯示，HIV-1 Vpr的72~83aa是線粒體毒性區(qū)域，73、77及80位氨基酸殘基對于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性中執(zhí)行重要功能[2]。73、77、80和84~96位氨基酸殘基是Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2停滯的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域[15]。本研究的序列對比分析發(fā)現(xiàn)，初始傳播病毒在第77、85和94位氨基酸存在點(diǎn)突變，提示上述氨基酸取代可能是其Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡活性提高的原因。這一設(shè)想及其具體的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和深入研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HIV-1Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞G2阻滯的能力與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力呈正相關(guān)，提示兩者的發(fā)生機(jī)制可能一致或者存在關(guān)聯(lián)性。

圖4 Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)果

A：慢性感染株MJ4-Vpr及初始傳播病毒Vpr分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析；B：慢性感染株MJ4 Vpr及初始傳播病毒 Vpr誘導(dǎo)293T細(xì)胞凋亡相對定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

表3 Vpr誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的定量化結(jié)果

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(責(zé)任編委: 謝建平)

Genetic variance in the HIV-1 founder virusaffects its ability to induce cell cycle G2arrest and cell apoptosis

Jianyuan Zhao1,2, Jiwei Ding2, Zeyun Mi2, Jinming Zhou2, Tao Wei1, Shan Cen2

In the event of acute infection, only a few HIV-1 viral variants can establish the initial productive clinical infection, and these viral variants are known as transmitted/founder viruses (T/F viruses). As one of the accessory proteins of HIV-1, viral protein R (Vpr) plays an important role in viral replication. Therefore, the characterization of T/F virus Vpr is beneficial to understand how virus replicates in a new host. In this study, flow cytometry was used to analyze the effect of G2arrest and cell apoptosis induced by the T/F virus Vpr and the chronic strain MJ4 Vpr. The results showed that the ability of T/F virus ZM246 Vpr and ZM247 Vpr inducing G2arrest and cell apoptosis are more potent than the MJ4 Vpr. The comparison of protein sequences indicated that the amino acids of 77, 85 and 94 contain high freqency mutations, suggesting that these sites may be involved in inducing G2arrest and cell apoptosis. Taken together, our work suggests that in acute infections, T/F viruses increase the capacity of G2arrest and cell apoptosis and promote viral replication and transmission in a new host by Vpr genetic mutation.

HIV-1; founder virus;; cell G2arrest; cell apoptosis

2015-01-04;

2015-01-29

北京聯(lián)合大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(編號：12246994501)和國家基金委-加拿大國立衛(wèi)生研究院研究基金課題(CIHR)合作基金(編號：81361128017)資助

趙建元，碩士研究生，專業(yè)方向：病毒學(xué)。E-mail: Zjyuan815@163.com

岑山，博士，研究員，研究方向：病毒學(xué)。E-mail: shancen@hotmail.com；魏濤，碩士，教授，研究方向：病毒學(xué)。E-mail: weitao@buu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-004

2015-3-18 14:48:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150318.1448.001.html