李小林 武密山 朱紫薇 鄧勇存 葉圓圓 趙素芝 任立中 王 茹 白 霞 韓紅偉 李 彬

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

地黃對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腰椎骨組織整合素 β1 mRNA表達的影響

李小林 武密山1朱紫薇2鄧勇存2葉圓圓2趙素芝3任立中4王 茹1白 霞1韓紅偉1李 彬5

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

目的 探討地黃對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨密度、腰椎骨組織整合素β1 mRNA表達的影響。方法 72只雌性大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組和地黃小、中、大劑量組。假手術(shù)組僅行假手術(shù)，其余五組行卵巢切除術(shù)。術(shù)后1 w分別灌胃給予17β-雌二醇和地黃小、中、大劑量，連續(xù)給藥3個月。測定血鈣、磷和堿性磷酸酶(ALP)，尿鈣(u-Ca)、磷、尿脫氧吡啶酚(D-Pyr)和肌酐(Cr)。之后處死動物，取出右側(cè)股骨，測定骨密度;取出第2腰椎，測定骨鈣(b-Ca)、磷(b-P)含量;取出第4腰椎，采用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定腰椎骨整合素 β1 mRNA表達。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組血清 ALP、u-Ca、D-Pyr/Cr顯著增加，股骨密度、腰椎骨整合素β1 mRNA表達均降低。與模型組比較，地黃中、大劑量組和雌二醇組均可使血清ALP、u-Ca、D-Pyr/Cr排出量降低，股骨密度、腰椎骨整合素β1 mRNA表達均增加。結(jié)論 地黃能抑制由于去卵巢雌激素缺乏引發(fā)的骨轉(zhuǎn)換增強，提高骨密度，促進腰椎骨組織整合素β1 mRNA表達，增強骨質(zhì)量。

骨質(zhì)疏松;地黃;骨密度;腰椎骨整合素

地黃 (Radix Rehmanniae)是玄參科植物地黃的塊根，是常用的滋陰中藥，其化學成分主要有環(huán)烯醚萜類和糖類，其中環(huán)烯醚萜類又以梓醇 (Catalpol)含量較高，為地黃中主要活性成分之一〔1〕。已往的研究表明，以地黃為主組成的補腎方藥具有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性〔2，3〕，提取地黃的主要活性成分梓醇可促進小鼠成骨細胞增殖、分化和礦化〔4〕。近年研究表明，整合素 (Itg)β1與成骨細胞活性密切相關(guān)〔5〕，尿脫氧吡啶酚 (D-Pyr)是目前最特異的骨吸收指標〔6〕。本實驗通過觀察地黃對大鼠股骨骨密度、骨組織 Itg β1 mRNA表達的影響，探討地黃防治去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨丟失和骨質(zhì)量下降的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 動物、主要儀器與試劑 3月齡SPF級雌性SD大鼠72只，體質(zhì)量(264±15)g，由河北省實驗動物中心提供〔許可證號:SCXK(冀)2003-1-003〕。Lunar-XR型雙能X線骨密度測定儀(美國Lunar公司產(chǎn)品)，RG-3000 Real-time PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)，美國MIS-2000 SP型3Y顯微圖像分析儀，SYBR GreenⅠ熒光染料(美國 Biotium公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(Takara公司)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，Taq DNA 聚合酶、dNTP(MBI公司)。17β-雌二醇(17β-E2，Sigma公司產(chǎn)品)，鈣、磷試劑盒、肌酐試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品)。地黃一次性購自石家莊市樂仁堂，藥材經(jīng)河北醫(yī)科大學中藥鑒定教研室鑒定為地黃，是玄參科植物地黃的塊根，加8倍量水，共同浸泡40 min，煮沸后文火煎煮 60 min，濾出藥液;藥渣加2倍水量繼續(xù)煎煮40 min，合并兩次濾液，水浴濃縮，每1 ml藥液含生藥 5.5 g。

1.2 造模與分組 健康3月齡SD雌性大鼠72只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組和地黃小、中、大劑量組，每組12只。將動物乙醚麻醉，腰背部兩側(cè)剪毛，75%乙醇消毒，假手術(shù)組大鼠從背部切口，找到卵巢后，只切除少量脂肪組織后縫合;其他各組均參照本實驗室的背馱式方法〔2〕從背側(cè)切口摘除雙側(cè)卵巢，縫合傷口，然后涂以紅霉素軟膏抗感染，于卵巢切除1 w后，給大鼠灌胃給藥:地黃小劑量組大鼠灌胃給予1.25 ml/kg地黃混懸液，地黃中劑量組大鼠灌胃給予2.5 ml/kg地黃混懸液，地黃大劑量組大鼠灌胃給予5 ml/kg地黃混懸液，對照組大鼠灌胃給予雌二醇混懸液(2 mg/kg)，假手術(shù)組和模型組分別灌胃給予等體積(5 ml/kg)的蒸餾水。連續(xù)給藥3個月后，腹主動脈取血，離心，分離出血清;取大鼠的第2、4腰椎和股骨，小心剝離，去除表面軟組織，保留完整骨膜，冷生理鹽水紗布冷藏保存。

1.3 骨密度(BMD)測定 取右側(cè)股骨，按文獻〔7〕分別測出股骨整體、股骨近端(股骨近側(cè)干骺端1/3)、股骨遠端(股骨遠側(cè)干骺端1/4)BMD，最終以平均值計。

1.4 骨鈣(b-Ca)、骨磷(b-P)含量測定 取第2腰椎，用10%三氯醋酸3 ml脫鈣3次，每次24 h，合并脫鈣液，取適量，用乙二胺四乙酸(EDTA)法測鈣，計算單位骨體積的含鈣量;用硫酸亞鐵法測磷，計算單位骨體積的含磷量。

1.5 尿鈣(u-Ca)、尿磷(u-P)、尿脫氧吡啶酚和肌酐(Cr)檢測實驗結(jié)束前1 d，用大鼠代謝籠收集大鼠24 h尿液，記錄尿量。用ELISA法測定D-Pyr的量，用全自動生化分析儀測定尿中鈣、磷和肌酐的量。

1.6 血清鈣(s-Ca)、血清磷(s-P)和ALP分析 大鼠用乙醚麻醉后，腹主動脈取血，離心，分離血清，用全自動生化分析儀測定s-Ca、s-P和ALP的活性。

1.7 子宮 取大鼠的子宮，迅速稱量，計算子宮臟器系數(shù)。

1.8 腰椎Itg β1 mRNA表達的檢測 引物由上海博亞生物工程公司依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫獲得基因序列合成。引物序列:正義 5′-ACC ACG ATT GTG ACT TTG TC-3′，反義 5′-CTC CCT CTG ATC ATC TCC GT-3′，擴增片段長度為 285 bp。β-actin引物序列:正義 5′-CGC GGC ACG TTG ATG TCA TG-3′，反義:5′-ATG TTA CGC TGT CCC TGT TG-3′，擴增片段長度為216 bp。①總RNA提取:采用 Trizol一步法提取腰椎總 RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，A260/A280均在1.8～2.0?？俁NA 濃度=OD260 值×8(μg/μl)，用前調(diào)整濃度至 1 μg/μl。②在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的作用下，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，反應(yīng)體系:H2O 5.5 μl，Oligo(dT 18)1.0 μl，tRNA 6.0 μl，Rnasin 0.5 μl，5×buffer 4.0 μl，10 mmol/L dNTP 2.0 μl，RTase 1.0 μl，反應(yīng)條件:42℃ 60 min，95℃ 5 min。③熒光定量 PCR反應(yīng)體系:cDNA 1 μl，10 ×buffer 5.0 μl，MgCl2(25 mmol/L)7.0 μl，10 mmol/L dNTP 1.0 μl，Primer F(20 pmol/μl)各0.8 μl，SYBR GreenⅠ1 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.5 μl。反應(yīng)條件:94℃ 30 min，94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，50 個循環(huán)。Cycle threshold(Ct)值的計算分析:待測樣品相對值 =2-△△Ct，△Ct=Ct陰性對照-Ct待測樣品，△△Ct=△Ct β-actin-△Ct待測樣品。

1.9 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 對股骨BMD，b-Ca、b-P含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組股骨 BMD、b-Ca、b-P含量明顯降低(P＜0.01)。與模型組相比，地黃中劑量組、地黃大劑量組、雌二醇組的股骨 BMD、b-Ca、b-P含量顯著增加(P＜0.01);地黃小劑量組的股骨 BMD、b-Ca、b-P含量無顯著增加(P＞0.05)。地黃中、大劑量組與雌二醇組之間無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠股骨BMD、b-Ca、b-P含量(±s，n=12)

表1 各組大鼠股骨BMD、b-Ca、b-P含量(±s，n=12)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜ 0.01，下表同

組別 股骨(g/cm2)第2腰椎b-Ca(mg/cm3) b-P(mg/cm3)0.198±0.017 0.365±0.013 0.134±0.003模型組 0.162±0.0161) 0.327±0.0151) 0.123±0.0051)雌二醇組 0.192±0.0172) 0.362±0.0222) 0.134±0.0062)地黃小劑量組 0.172±0.018 0.331±0.023 0.125±0.007地黃中劑量組 0.191±0.0172) 0.357±0.0252) 0.133±0.0082)地黃大劑量組 0.192±0.0182) 0.358±0.0242) 0.134±0.0062)假手術(shù)組

2.2 對u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影響 與假手術(shù)組比較，模型組 u-Ca、D-Pyr/Cr顯著增加(P＜0.01)，u-P 無明顯變化(P＞0.05)。與模型組相比，地黃中劑量組、地黃大劑量組、雌二醇組 u-Ca、D-Pyr/Cr顯著減少(P＜0.01)，u-P 無明顯變化(P＞0.05);地黃小劑量組 u-Ca、D-Pyr/Cr含量無顯著增加(P＞0.05)，u-P 無明顯變化(P＞0.05)。見表2。

2.3 對s-Ca、s-P、ALP和子宮臟器系數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組血清ALP顯著增加(P＜0.01)，子宮臟器系數(shù)降低(P＜0.01)，s-Ca 、s-P 無明顯變化(P＞0.05)。與模型組相比，地黃中劑量組、地黃大劑量組、雌二醇組 ALP活性顯著降低(P＜0.01)，地黃中劑量組、地黃大劑量組子宮臟器系數(shù)無顯著增加(P＞0.05)，雌二醇組的子宮臟器系數(shù)升高(P＜0.01)，各組s-Ca、s-P無明顯變化(P＞0.05);地黃小劑量組 ALP活性無顯著降低(P＞0.05)，子宮臟器系數(shù)無顯著增加(P＞0.05)。見表3。

表2 地黃對各組大鼠u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影響(±s，n=12)

表2 地黃對各組大鼠u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影響(±s，n=12)

組別D-Pyr/Cr(mmol/mg)u-Ca(mg/mg)u-P(mg/mg)4.81±0.62 0.82±0.14 1.84±0.16模型組 8.65±0.711) 1.34±0.171) 1.71±0.18雌二醇組 5.38±0.762) 0.89±0.172) 1.75±0.19地黃小劑量組 4.95±0.64 1.01±0.15 1.76±0.18地黃中劑量組 5.26±0.732) 0.85±0.192) 1.78±0.16地黃大劑量組 5.32±0.782) 0.84±0.212)假手術(shù)組1.77±0.17

表3 地黃對各組大鼠s-Ca、s-P、ALP和子宮臟器系數(shù)的影響(±s，n=12)

表3 地黃對各組大鼠s-Ca、s-P、ALP和子宮臟器系數(shù)的影響(±s，n=12)

組別 子宮/體重(mg/g)ALP(U/L)s-Ca(mg/L)s-P(mg/L)1.86±0.10 74.13±9.64 11.03±0.21 3.09±0.12模型組 0.42±0.081)99.24±8.521)10.37±0.16 3.14±0.15雌二醇組 1.13±0.062)76.25±8.132)10.44±0.18 3.15±0.17地黃小劑量組 0.47±0.071)88.28±10.12 10.43±0.16 3.13±0.16地黃中劑量組 0.45±0.051)75.26±9.132)10.64±0.15 3.12±0.13地黃大劑量組 0.44±0.061)74.53±10.252)假手術(shù)組10.53±0.18 3.10±0.15

2.4 對腰椎Itg β1 mRNA表達的影響 與假手術(shù)組(1.71±0.16)比較，模型組 Itg β1 mRNA 表達(1.49±0.15)明顯降低(P＜ 0.01)。與模型組相比，地黃中劑量組(1.73±0.16)、地黃大劑量組(1.74±0.17)、雌二醇組(1.72±0.14)Itg β1 mRNA 表達顯著增加(P＜0.01);地黃小劑量組 Itg β1 mRNA 表達(1.57±0.17)無顯著增加(P＞0.05)。地黃中、大劑量組與雌二醇組之間比較無明顯差異(P＞0.05)。

3 討論

絕經(jīng)后婦女卵巢功能減退，雌激素水平降低，骨吸收亢進，造成骨質(zhì)流失，與老齡造成的低轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松相比，絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松屬于高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松。臨床觀察絕經(jīng)后婦女血清ALP活性升高，u-Ca、尿D-Pyr排出量增加，骨吸收強于骨形成〔8〕。骨基質(zhì)中90%是骨膠纖維，膠原吡啶交聯(lián)包括吡啶酚(Pyr)和D-Pyr兩種成熟的交聯(lián)氨基酸，D-Pyr只存在于骨骼和牙質(zhì)的Ⅰ型膠原中，因牙質(zhì)轉(zhuǎn)換速度慢，在整體骨骼所占的份額極小，故尿中的D-Pyr幾乎全來自礦化骨的骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)Pyr和D-Pyr在絕經(jīng)時增加50% ～100%，經(jīng)雌激素治療后可降至絕經(jīng)前水平，并在絕經(jīng)兩年的追蹤研究后發(fā)現(xiàn)，D-Pyr與骨丟失率顯著相關(guān)〔9〕。本實驗采用去卵巢大鼠模擬絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松，結(jié)果顯示，去卵巢后大鼠血清ALP活性增加，u-Ca、D-Pyr/Cr排出顯著增加，與絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松患者的臨床生化指標的變化一致。ALP反映成骨細胞的成骨活性〔10〕，本研究通過卵巢切除人為地造成卵巢功能破壞，雌激素水平下降，骨吸收代謝加強，骨基質(zhì)中的Ⅰ型膠原分解加速，骨丟失率顯著上升，造成雌激素缺乏引起的骨轉(zhuǎn)換亢進骨質(zhì)疏松病理模型;并且與雌二醇組相比，長期服用地黃對子宮沒有刺激增生的作用。

Itg是一組細胞表面跨膜糖蛋白，由α、β兩個亞單位以非共價鍵結(jié)合構(gòu)成異二聚體。Itg由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)3部分組成，其膜外部分可識別配體，如纖維黏連蛋白、尿黏連蛋白和膠原等，而胞內(nèi)端除可與細胞骨架等結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合外，還可與多種信號蛋白如局部黏附蛋白、Itg連接激酶、蛋白激酶 C等結(jié)合，在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用〔11〕。Itg β1在細胞的錨定、生長、增殖、分化等方面起著重要作用〔12〕。Itg是細胞表面跨膜蛋白，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)間黏附作用，參與細胞的信號傳遞和功能調(diào)控。Itg β1亞基是占比例最大的Itg家族，在骨組織中廣泛存在，成骨細胞(OB)Itg的表達水平影響其與ECM的結(jié)合能力〔13〕，OB的成骨功能與其Itg的表達水平密切相關(guān)〔5〕。OB在Itg β1的介導下，與多種骨基質(zhì)蛋白(如Ⅰ型膠原、纖維黏連蛋白、玻璃黏連蛋白等)結(jié)合，激活細胞內(nèi)黏著斑激酶(FAK)活性，引起細胞形態(tài)改變、細胞骨架重建、細胞有絲分裂活性提高，促進成骨細胞分化、成熟〔14〕。ECM→整合素→黏著斑激酶→細胞骨架，構(gòu)成了Itg信號轉(zhuǎn)導通路，將細胞外信息傳遞到細胞內(nèi)，調(diào)控基因表達，行使功能〔15〕。Itg結(jié)合配體后，胞內(nèi)的黏著斑激酶(FAK)被激活，引起細胞形態(tài)改變，細胞骨架重建，促進OB分化、成熟，細胞外的信息，就通過配體→Itg→FAK傳入細胞內(nèi)。Itg β1表達的減少，或者與配體結(jié)合的減少，均導致OG功能的減退〔16〕。

實驗結(jié)果顯示，模型組骨組織中Itg β1 mRNA表達低于假手術(shù)組，提示卵巢切除后OB與ECM黏附能力下降，OB的成骨活性不足。用藥后，地黃組骨組織中Itg β1 mRNA表達水平明顯增加。一方面提示OB與ECM的黏附能力增強，使OB的成骨活性提高;另一方面由于Itg是理想的信號轉(zhuǎn)導分子，Itg β1 mRNA表達可能通過相關(guān)信號的轉(zhuǎn)導，促進OB增殖與分化，延緩Itg的凋亡，使OB數(shù)量增加，從而扭轉(zhuǎn)了因雌激素下降出現(xiàn)的成骨不足病理態(tài)勢。

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The experimental study of the effects of Radix Rehmanniae on the expression of the forth lumbar vertebrae osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA in ovariectomized osteoporosis model rats

LI Xiao-Lin，WU Mi-Shan，ZHU Zi-Wei，et al.
Department of Traditional Chinese Medicine，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，Hebei，China

ObjectiveTo explore the influence of Radix Rehmanniae on bone mineral density(BMD)of femur，the expression of the forth lumbar vertebrae osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA in ovariectomized osteoporosis model rats .Methods72 Sprague Dawley female rats were randomly divided into sham，model，17 β-estrogen treated and Radix Rehmanniae treated groups(1.25，2.5，5 ml/kg).The sham group was only sham operated and the other five groups were ovariectomized respectively.One week after ovariectomy，the rats were given Radix Rehmanniae(1.25，2.5，5 ml/kg)and 17 β-estrogen(2 mg/kg)by intragastric administration for three months sustainedly.Serum contents of calcium(s-Ca)，phosphorus(s-P)，alkaline phosphate(ALP)and levels of urinary deoxypyridinoline(D-Pyr)，urine contents of calcium(u-Ca)，phosphorus(u-P)and creatinine(Cr)were detected.Rats were sacrificed at the end of the experiment.The thighbone was taken out to determine bone mineral density(BMD).The second lumbar vertebra was taken out to determine contents of calcium(b-Ca)and phosphorus(b-P).The forth lumbar vertebrae(LV4)was taken out to FQ-PCR for testing the expression of forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA.ResultsCompared with those of sham group，serum ALP activity as well as u-Ca and urinary D-Pyr/Cr significantly were increased in ovariectomized rats.BMD of femur，and the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA was significantly decreased in model group.Compared with that of model group，middle and high doses of Radix Rehmanniae and 17 βestrogen inhibited serum ALP activity inhibit，and u-Ca，urinary D-Pyr/Cr reduce.BMD of femur，and the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA were increased in middle and high doses of Radix Rehmanniae groups.ConclusionsRadix Rehmanniae could inhibit the high rate of turn-over induced by ovariectomy in rats，significantly raise BMD of the thighbone and improve the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA，and activate bone metabolism to reinforce quality of the bone.

Osteroporosis;Radix Rehmanniae;Bone mineral density(BMD);Osseous integrin beta 1(Itg β1)

李小林(1957-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事中藥治療風濕骨病作用機制研究。

R151.2

A

1005-9202(2015)09-2319-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.007

國家自然科學基金資助項目 (81073074，30472200);河北省自然科學基金項目(H2013206005);河北省留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助項目 (200828);河北省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310089062)

1 河北中醫(yī)學院方劑學教研室

2 河北中醫(yī)學院2011級中醫(yī)學專業(yè)

3 石家莊市橋東區(qū)勝北社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心

4 河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院骨科 5 河北醫(yī)科大學生物化學教研室

武密山 (1966-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事補腎中藥治療骨質(zhì)疏松作用機制研究。

〔2013-11-26修回〕

(編輯 袁左鳴)