李明波，雷彬，董斌科，梅書棋，陳明銀，劉心建

摘要：通過PCR方法對(duì)湖北某試驗(yàn)豬場(chǎng)3份疑似患斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）的仔豬和一份死胎樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果4份組織病料中均擴(kuò)增到494 bp大小的PCV2-DNA片段，而偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）檢測(cè)為陰性。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和Blast同源性分析發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)的PCV2病毒為PCV2b亞型，其ORF2基因全長為702 bp，與PCV2-WH株、PCV2-HB WH24毒株的核苷酸序列同源性分別為94%和99%。通過試驗(yàn)研究，明確了該試驗(yàn)豬場(chǎng)豬群中保育仔豬的主要感染病原為PCV2，為更好地應(yīng)用疫苗防控該病和研究綜合控制技術(shù)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;ORF2基因;檢測(cè)與分析

中圖分類號(hào)：S858.28 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5798-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.044

豬圓環(huán)病毒?。≒CV2）是由圓環(huán)病毒2型引起的一系列疾病的總稱，包括斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）、出生豬的先天震顫和生長豬的皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、青年母豬的流產(chǎn)及產(chǎn)死胎等。斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）是臨床較常見、造成經(jīng)濟(jì)損失較大的豬圓環(huán)病毒病，臨床患PMWS的仔豬表現(xiàn)為皮膚蒼白、呼吸道癥狀、進(jìn)行性消瘦、腹股溝淋巴結(jié)腫大和生長發(fā)育不整齊，容易繼發(fā)細(xì)菌感染等。PCV2對(duì)環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，可經(jīng)豬的唾液、鼻腔、糞尿、乳汁、胎盤和公豬精液等途徑傳播。豬圓環(huán)病毒病嚴(yán)重影響了仔豬的生長性能，表現(xiàn)為養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)持續(xù)性感染，是其他豬病多發(fā)和頻發(fā)的主要原因之一。

PCV2為環(huán)狀、單股DNA病毒，由衣殼蛋白（Cap蛋白，由ORF2編碼）和核酸組成（含1 767/1 768個(gè)核苷酸）[1]。研究表明世界范圍內(nèi)PCV2病毒的抗原決定簇核苷酸序列的同源性高達(dá)93%以上[2]。PCV2主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，單核/巨噬細(xì)胞系（如肺泡巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等）是病毒感染豬后的靶細(xì)胞，可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量減少及凋亡，造成免疫抑制，使感染豬的免疫應(yīng)答作用降低。PCV2毒株可分為PCV2a/PCV2b基因亞型，根據(jù)對(duì)臨床PCV2毒株的序列分析表明，PCV2b是當(dāng)前國內(nèi)豬群中的主要優(yōu)勢(shì)毒株，且PCV2b比PCV2a的毒力更強(qiáng)，這兩個(gè)基因型間的不同僅存在ORF2之間的差異[3]。

臨床上PCV2感染豬引起的病理變化主要是水腫，如間質(zhì)性肺炎、淋巴結(jié)水腫、腸系膜水腫、心臟冠狀溝的膠凍樣水腫等，在炎癥過程中體液或組織液的滲出是宿主感染病毒后的重要發(fā)展規(guī)律?；糚MWS豬的臨床癥狀則較為復(fù)雜，原因是PCV2常與其他因子協(xié)同致病從而加重病情，這些因子包括病原微生物（豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌等）、免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑藥物（地塞米松）等[4]。本研究通過PCR方法對(duì)湖北某試驗(yàn)豬場(chǎng)3份疑似患斷奶仔豬衰竭綜合征（PMWS）的仔豬和一份死胎樣本進(jìn)行了檢測(cè)，明確了該試驗(yàn)豬場(chǎng)豬群中保育仔豬的主要感染病原，旨在為該病的防控提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病料來源 ?某試驗(yàn)原種場(chǎng)內(nèi)臨床疑似患PMWS的保育仔豬3頭（50～60日齡）和死胎1頭。發(fā)病仔豬臨床癥狀：體溫41～42 ℃，呼吸困難進(jìn)而衰竭，進(jìn)行性消瘦，皮膚蒼白、被毛粗亂等。病理剖檢變化：心包、胸膜等處有少量纖維素性蛋白滲出，胸腔積液，肺臟出血（部分組織出現(xiàn)肉變），腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)腫大出血、切面呈蒼白色，腎臟及胃黏膜均有出血點(diǎn)等。選取臨床癥狀典型的病豬進(jìn)行解剖，并采集肺臟組織、淋巴結(jié)等病料。

1.1.2 ?引物 ?參照文獻(xiàn)[5]，根據(jù)GenBank中的PCV2-ORF2保守基因序列（編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白）設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，上游引物P1：5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物P2：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′。檢測(cè)偽狂犬野毒（PRV-gE基因）和豬繁殖與呼吸綜合征經(jīng)典和變異毒株（PRRSV-Nsp2基因）引物由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?PCR檢測(cè) ?從采集的病豬肺臟和淋巴結(jié)組織提取PCV2-DNA模板，再配置PCR反應(yīng)體系（單重?cái)U(kuò)增）：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上、下游引物（10 mmol/L）各1 μL、模板4 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL、滅菌水14.35 μL，總反應(yīng)體系25 μL。

將配好的樣品放入PCR管進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度為54 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min;94 ℃30 s，54 ℃40 s，72 ℃45 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

檢測(cè)偽狂犬野毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物和技術(shù)方法由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2 ?產(chǎn)物測(cè)序和Blast比對(duì) ?將擴(kuò)增的ORF2-DNA產(chǎn)物回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序的結(jié)果與GenBank上登錄的PCV2病毒（包括疫苗株）相關(guān)序列進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?PCV2-ORF2基因的擴(kuò)增和其他病原的檢測(cè)結(jié)果

圓環(huán)病毒（PCV2）檢測(cè)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)：試驗(yàn)以圓環(huán)病毒的PCV2衣殼（Cap）蛋白為目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠從陽性模板中擴(kuò)增出494 bp的片段。如果樣品中有PCV2存在，則能夠擴(kuò)增出494 bp大小的條帶。由圖1可見，4份組織樣品中均能擴(kuò)增出494 bp大小的條帶，表明4份組織樣品中均能檢測(cè)出PCV2。

由表1可見，4份組織（肺臟和淋巴結(jié)）樣品中均可檢測(cè)出PCV2，未檢測(cè)出偽狂犬野毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（經(jīng)典和變異毒株）。

2.2 ?PCV2-ORF2基因的測(cè)序和Blast比對(duì)

將擴(kuò)增的PCV2-ORF2基因克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，其大小為702 bp，具體見圖2。

將臨床PCV2-ORF2基因序列與GenBnak中登錄毒株P(guān)CV2-WH（PCV2b亞型，登錄號(hào)FJ598044）和PCV2-HB WH24（PCV2b亞型，登錄號(hào)FJ870971）用Blast軟件比較其同源性，結(jié)果其同源性分別為94%和99%（圖3）。

3 ?小結(jié)與討論

豬圓環(huán)病毒（PCV2）的致病性與病毒感染劑量、母源抗體水平以及感染時(shí)的日齡有關(guān)。由于健康豬體內(nèi)可攜帶病毒而不出現(xiàn)臨床癥狀，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)PMWS病豬和臨床健康豬腸系膜淋巴結(jié)、血清樣品中病毒DNA含量檢測(cè)表明，每毫升血清或500 ng組織樣品中PMWS病毒含量大于107，而健康豬小于106 [6]。因此，在發(fā)病豬的組織中，通常檢出107拷貝的病毒DNA，這就要求實(shí)驗(yàn)室在病料定性檢測(cè)為PCV2陽性時(shí)，仍需定量測(cè)定病毒含量。

本試驗(yàn)通過對(duì)臨床患PMW品的病豬及死胎組織樣品進(jìn)行PCV2、PRV、PRRSV相關(guān)基因的PCR定性檢測(cè)，結(jié)果表明：

1）該豬場(chǎng)臨床PCV2毒株與疫苗毒株（PCV2-WH株）和湖北某地區(qū)另一分離毒株（PCV2-HB WH24株）有較高的同源性，而這兩個(gè)毒株均為PCV2b基因亞型，病毒的DNA大小均為1 767 bp，從而推斷PCV2b基因亞型為檢測(cè)豬群的主要優(yōu)勢(shì)毒株。

2）3份已免疫PCV2滅活疫苗的保育豬組織樣本中PCV2病毒PCR定性檢測(cè)呈較強(qiáng)陽性，而死胎組織呈弱陽性，表明仔豬在某一階段或出生前感染了病毒。雖然ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2良好的免疫蛋白，這也提示病毒ORF2基因內(nèi)較小的差異可能造成疫苗毒對(duì)臨床毒株不能起到良好保護(hù)效果。此外，PCV2滅活疫苗的臨床免疫效果還與商品疫苗的抗原滴度大小、疫苗佐劑、免疫方式、豬只是否攜帶其他病原等因素密切相關(guān)。

3）該豬場(chǎng)引起保育豬發(fā)病的病原主要是PCV2，由于PCV2可引起機(jī)體免疫抑制，容易造成細(xì)菌繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌病、豬肺炎支原體、鏈球菌病等，在前期的試驗(yàn)研究中鑒定了該豬場(chǎng)引起副豬嗜血桿菌病的菌株血清型為2、4、13型，提示在防控PMWS和制定免疫程序時(shí)應(yīng)該加強(qiáng)副豬嗜血桿菌病（HPS）疫苗和豬肺炎支原體疫苗的有效免疫，同時(shí)在斷奶-保育仔豬階段進(jìn)行飼料給藥預(yù)防控制是非常必要的（如大環(huán)內(nèi)酯類藥物、免疫增強(qiáng)劑、抗應(yīng)激藥物等）。

近年來，國內(nèi)外研究者在PCV2的病原學(xué)、分子和臨床致病機(jī)理、疫苗開發(fā)、免疫效果評(píng)價(jià)等方面開展并取得了較好的研究成果，使該病的臨床發(fā)病率有效降低，提高了仔豬存活率和生產(chǎn)成績。但仍有關(guān)于PCV2的未知毒力基因和其他病毒復(fù)制相關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還不甚了解;同時(shí)，病毒與其他病原協(xié)同感染機(jī)制、免疫與感染的鑒別診斷技術(shù)、疫苗開發(fā)等方面需要進(jìn)一步的探索和研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 斯特勞，趙德明，張仲秋，等.豬病學(xué)[M].第九版. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.313-318.

[2] LAROCHELLE R，MAGAR R，DALLAIRE S. Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2（PCV2）strains from cases presenting various clinical conditions[J]. Virus Res，2002，90：101-102.

[3] 劉 ?健，張維誼，鞠厚斌，等.豬圓環(huán)病毒2a/2b亞型病毒株毒力分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（2）：23-27.

[4] 韋 ?平，秦愛建.重要?jiǎng)游锊《痉肿由飳W(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.478-496.

[5] 李文潔，李文濤，嚴(yán)偉東，等.中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的基因型分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（9）：1358-1362.

[6] BRUNBORG I M，MOLDAL T，JONASSEN C M.Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of healthy pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome using a TaqMan-based real-time PCR[J]. J Virol Methods， 2004，122（2）：171-178.