查中萍，萬丙良，杜雪樹，殷得所，戚華雄

摘要：對海洋硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NAT3編碼基因的單拷貝插入轉(zhuǎn)基因水稻純系進(jìn)行熒光定量PCR檢測，獲得NAT3基因的超表達(dá)株系。NAT3超表達(dá)株系中硝酸還原酶基因OsNR1的轉(zhuǎn)錄較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1顯著增強(qiáng)。對超表達(dá)株系及對照中花11進(jìn)行不同氮素濃度的培養(yǎng)和栽培試驗(yàn)。結(jié)果表明，在低氮培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)NAT3基因水稻的幼苗干重較中花11高;在低氮盆栽條件下，轉(zhuǎn)NAT3基因超表達(dá)株系的葉綠素含量、生物學(xué)產(chǎn)量和植株的含氮量均較相同氮素條件下的中花11高，說明NAT3基因超表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因水稻在低氮條件下的氮素利用效率，促進(jìn)水稻生長。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;氮素利用效率

中圖分類號：S511 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5653-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.009

水稻是我國主要的糧食作物，種植面積占糧食作物總面積的27%，產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的44%[1]。長期以來，水稻育種多以高產(chǎn)、耐肥抗倒作為主要育種目標(biāo)，因?yàn)樽非蟾弋a(chǎn)導(dǎo)致氮肥施用量大幅度增加[2]。大量氮肥的使用不僅提高了水稻的種植成本，導(dǎo)致增產(chǎn)不增收，而且還帶來水體硝酸鹽污染的潛在危險(xiǎn)，對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生極為不利的影響[3]。由于氮肥利用率的下降，氮肥過量施用造成的環(huán)境負(fù)效應(yīng)也越來越引起廣泛關(guān)注[4-8]。因此，通過遺傳改良提高水稻品種的氮素吸收利用能力，降低氮肥使用量是發(fā)展水稻生產(chǎn)急需解決的重要問題。

水稻根系對土壤中氮素的吸收是決定水稻氮素利用效率的前提。硝酸鹽是植物可直接利用的主要氮源之一，植物對硝酸鹽的吸收主要依靠硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成。深海硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與氮具有高度親和性，在低氮環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，可使硅藻從硝酸鹽濃度極低的海水中富集硝酸鹽[9]。NAT3是劉昱輝等[10]從深海硅藻中克隆的一個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將NAT3基因?qū)胨酒贩N中花11，獲得了NAT3基因的轉(zhuǎn)基因植株[11]。本研究通過熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因水稻中NAT3基因表達(dá)量進(jìn)行分析，獲得NAT3基因超表達(dá)純系，并進(jìn)一步通過不同氮濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)及盆栽試驗(yàn)，測定轉(zhuǎn)基因水稻與對照受體材料中花11的生長量及植株含氮量，并分析NAT3基因的表達(dá)對轉(zhuǎn)基因水稻的氮素利用率的影響，為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育氮肥高效利用水稻提供理論依據(jù)。本研究對減少水稻生產(chǎn)中的氮肥施用量、節(jié)約水稻生產(chǎn)成本、降低環(huán)境污染、促進(jìn)農(nóng)業(yè)高效節(jié)能可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因株系是以中花11為受體的轉(zhuǎn)NAT3基因T4代單拷貝插入純系[11]。非轉(zhuǎn)基因水稻對照材料為中花11，由湖北省糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。

1.2 ?NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1表達(dá)量的測定

取三葉一心期的水稻幼苗（包括根），利用Trizol試劑抽提總RNA，通過瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)測定RNA質(zhì)量和濃度。取5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA，采用Roche公司的定量檢測試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）進(jìn)行定量PCR分析，內(nèi)標(biāo)基因?yàn)閍ctin基因。引物由Invitrogen中國公司合成。擴(kuò)增體系25 μL，其中12.5 μL 2× qPCR Mix ，2.0 μL引物，2.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8.0 μL ddH2O 。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃，10 min;95 ℃變性15 s， 58 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s， 40 次循環(huán);72 ℃延伸5 min。采用ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果處理。

1.3 ?不同氮濃度培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)NAT3基因水稻幼苗的生長狀況測定

NAT3基因超表達(dá)株系及對照中花11的成熟胚經(jīng)消毒后，于MS培養(yǎng)基上獲得無菌苗，選取生長狀況一致的幼苗，去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3個(gè)不同氮濃度的培養(yǎng)基上（1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培養(yǎng)基中大量元素中的氮素減半，其余成分不變）。每個(gè)處理種植5株，40 d后取樣，測定各處理5個(gè)植株的整株干重。

1.4 ?轉(zhuǎn)NAT3基因水稻盆栽試驗(yàn)

盆栽基土為含氮量低的黃棕壤，堿解氮含量74.57 mg/kg。曬干后稱取8 kg/（盆·干土），分別按不同氮素處理加入相應(yīng)的營養(yǎng)元素。盆栽試驗(yàn)氮肥處理濃度設(shè)計(jì)如表1所示，在施用相同磷、鉀肥的基礎(chǔ)上，設(shè)4個(gè)氮素處理，分別為全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白對照），分基肥、分蘗肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表達(dá)株系及對照中花11種子在育秧盤中播種，至四葉一心時(shí)選取生長一致的幼苗移栽，每盆種植4株，每個(gè)氮素處理種植6盆。抽穗期取3盆植株進(jìn)行葉片葉綠素含量。成熟后另外3盆收獲整個(gè)植株（包括根系），烘干后測定生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量。

1.5 ?葉綠素含量測定

抽穗期取倒二葉片，每個(gè)處理取3個(gè)葉片，每個(gè)葉片測定2次。參考文獻(xiàn)[12]測定葉綠素含量。

1.6 ?水稻植株含氮量及生物學(xué)產(chǎn)量測定

收獲轉(zhuǎn)基因株系及對照水稻整個(gè)植株（包括根系），洗凈烘干后稱重待測。用凱氏定氮法測定植株含氮量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?轉(zhuǎn)基因株系中NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1的表達(dá)

不同轉(zhuǎn)基因株系中NAT3和OsNR1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況如圖1所示。10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有8個(gè)株系的NAT3基因有不同程度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因轉(zhuǎn)錄量較高，而株系T4-9、T4-10及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1中無NAT3基因轉(zhuǎn)錄。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有較高的表達(dá)量，高于在其他轉(zhuǎn)基因株系與中花11中的表達(dá)量。OsNR1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)趨勢與NAT3基因的表達(dá)趨勢基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)。結(jié)果說明，NAT3基因整合到水稻基因組中后，能夠正常表達(dá)，而且其超表達(dá)促進(jìn)了下游硝酸還原酶OsNR1基因的表達(dá)。選擇NAT3和OsNR1基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系T4-1、T4-2及T4-3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2 ?不同氮濃度培養(yǎng)基上NAT3基因超表達(dá)株系幼苗的生長狀況

在不同氮濃度培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)基因株系T4-1、T4-2、T4-3及對照中花11幼苗的干重結(jié)果如表2所示。由表2可知，在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3種氮濃度培養(yǎng)基上，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系40 d齡幼苗的干重均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1的幼苗干重，其中在1/4MS和1/8MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因株系的幼苗干重與對照之間的差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）。結(jié)果表明，同對照相比，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在低氮環(huán)境下的生長速度快于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?/p>

2.3 ?NAT3基因超表達(dá)水稻葉綠素含量分析

不同氮素營養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1抽穗期倒二葉葉綠素含量如表3所示。由表3可知，隨著氮素使用量的降低，NAT3基因超表達(dá)株系及中花11的葉片葉綠素a和葉綠素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素a含量較對照中花11高，但無顯著差異（P<0.05）;T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮條件下的葉綠素b含量均顯著（P<0.05）高于對照中花11。結(jié)果表明，在低氮環(huán)境下NAT3基因超表達(dá)株系葉綠素含量較對照有所增加，其中株系T4-3中葉綠素b含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?/p>

2.4 ?NAT3基因超表達(dá)水稻植株含氮量及生物學(xué)產(chǎn)量

不同氮素營養(yǎng)條件下，NAT3基因超表達(dá)株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1的含氮量和生物學(xué)產(chǎn)量結(jié)果如表4所示。由表4可知，轉(zhuǎn)基因株系在1/3N、1/6N的條件下，其植株的生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量均高于對照，其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮條件下，其生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量較對照的差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）;T4-3株系在1/3N、1/6N低氮條件下的生物學(xué)產(chǎn)量較對照的差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）。說明NAT3基因的超表達(dá)能提高水稻對氮肥的利用效率，提高植株含氮量和生物學(xué)產(chǎn)量。

3 ?小結(jié)與討論

硝態(tài)氮（NO3-）是植物吸收利用的主要氮源之一。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成部分，分為低親和性和高親和性兩類。大量研究已經(jīng)證明，高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)低NO3-濃度時(shí)植物氮的吸收[13-15]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT2.1缺失突變的擬南芥喪失75%的高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性[16，17]，因此導(dǎo)致在以NO3-為惟一氮源的低氮環(huán)境下不能正常生長[18]。然而通過在植物中超表達(dá)高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因改變植物的氮素利用效率的研究鮮有。Fraisier等[19]在煙草中超表達(dá)高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NpNRT2.1，結(jié)果表明，不論環(huán)境中提供的NO3-濃度水平如何，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型對照中的NO3-含量無顯著差異。

本研究中，NAT3基因在水稻中超表達(dá)后，促進(jìn)了硝酸還原酶OsNR1基因的表達(dá)。在低氮條件下，轉(zhuǎn)基因植株的含氮量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭?，表明NAT3基因的超表達(dá)在低氮環(huán)境下促進(jìn)了氮的吸收。在正常氮水平條件下，NAT3基因的超表達(dá)并不能促進(jìn)氮的吸收。這是因?yàn)镹AT3屬于高親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使其主要在低氮環(huán)境下起作用[20]。同轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率增強(qiáng)一致，在低氮環(huán)境下轉(zhuǎn)NAT3基因水稻的生物學(xué)產(chǎn)量和葉片葉綠素含量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站兴岣?。但轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素含量、葉片葉綠素含量和生物學(xué)產(chǎn)量均低于正常環(huán)境下的相應(yīng)指標(biāo)，說明，轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率雖然有所提高，但在本試驗(yàn)所設(shè)置的低氮條件下仍未達(dá)到滿足水稻正常生長發(fā)育所需的水平。

中國的水稻氮肥施用量占全球水稻氮肥施用量的37%，氮肥利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于全球的平均水平[21]。過量施用氮肥導(dǎo)致環(huán)境污染，也增加了農(nóng)民的水稻種植成本。本研究獲得的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NAT3轉(zhuǎn)基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，為利用生物技術(shù)提高水稻的氮素利用效率、減少氮肥的過量使用提供了有效的技術(shù)途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 程式華，李 ?建.現(xiàn)代中國水稻[M]北京：金盾出版社，2007.

[2] 王虹玲，闞國仕，李珊珊，等.利用同源轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（5）：862-869.

[3] VERMEERI T M， PACHEN D M A A，DALLINGA J W，et al. Nitrosmnine formation after intake of nitrate at the ADI leveI in combination with an amine-rich diet[J].Environ Health Perspect，1998，106（8）：459-463.

[4] 朱兆良.農(nóng)田中氮肥的損失與對策[J].土壤與環(huán)境，2000，9（1）：1-6.

[5] 沈善敏.氮肥在中國農(nóng)業(yè)發(fā)展中的共性和農(nóng)業(yè)中氮的損失[J].土壤學(xué)報(bào)，2002，39（增刊）：12-25.

[6] 李菊梅，徐明崗，秦道珠，等.有機(jī)無機(jī)肥配施對稻田氨揮發(fā)和水稻產(chǎn)量的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2005，11（1）：51-56.

[7] 羅志祥，蘇澤勝，施伏芝，等.氮肥高效利用水稻育種的現(xiàn)狀與展望[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2003，19（1）：65-67.

[8] TAKAYUKI A， MASATAKA W， NAOHIRO A， et al. Overexpression of a calcium-dependent protein kinase gene enhances growth of rice under low-nitrogen conditions[J]. Plant Biotechnology ， 2010，27：369-373 .

[9] HILDEBRAND M， DAHLIN K. Nitrate transporter genes from the diatom Cylindrotheca fusiformis （Bacillariophyceae）： mRNA levels controlled by nitrogen source and by the cell cycle[J]. Journal of Phycology， 2000，36（4）：702-713.

[10] 劉昱輝， 賈士榮， 伍祥貴，等.硅藻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用[P].中國發(fā)明專利，CN1887903A.2007，1，3.

[11] 查中萍，萬丙良，杜雪樹，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的氮高效利用轉(zhuǎn)基因植株的獲得[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（24）：5247-5249.

[12] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2007.

[13] FRAISIER V， GOJON A， TILLARD P， et al. Constitutive expression of a putative high-affinity nitrate transporter in Nicotiana plumbaginifolia： evidence for post-transcriptional regulation by a reduced nitrogen source[J]. The Plant Journal， 2000，23（4）：489-496.

[14] DANIEL V F， FILLEUR S， CABOCHE M. Nitrate transport： a key step in nitrate assimilation[J]. Current opinion in plant biology，1998，1（3）：235-239.

[15] KRAPP A， FRAISIER V， SCHEIBLE W R，et. al. Expression studies of Nrt2： 1Np， a putative high-affinity nitrate transporter： evidence for its role in nitrate uptake[J]. The Plant Journal， 1998，14（6）：723-731.

[16] FILLEUR S， DANIEL V F. Expression analysis of a high-affinity nitrate transporter isolated from Arabidopsis thaliana by differential display[J]. Planta， 1999，207（3）：461-469.

[17] LI W， WANG Y， OKAMOTO M， et. al.Dissection of the AtNRT2.1：AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster[J]. Plant Physiol，2007，143：425-433.

[18] ORSEL M， EULENBURG K， KRAPP A， et al. Disruption of the nitrate transporter genes AtNRT2.1 and AtNRT2.2 restricts growth at low external nitrate concentration[J]. Planta， 2004，219： 714-721.

[19] FILLEUR S， DORBE M F， CEREZO M， et al.An Arabidopsis T-DNA mutant affected in Nrt2 genes is impaired in nitrate uptake[J]. FEBS Lett， 2001，489：220-224.

[20] LAUGIER E， BOUGUYON E， MAURIS A， et al. Regulation of high-affinity nitrate uptake in roots of Arabidopsis depends predominantly on posttranscriptional control of the NRT2.1/NAR2.1 transport system[J]. Plant physiology， 2012，158（2）：1067-1078.

[21] 彭少兵，黃見良，鐘旭華，等.提高中國稻田氮肥利用率的研究策略[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（9）：1095-1103.