蔣云露，楊建濤，王猛，羅軍，蔣倩，姜露熙，張琴，饒瑜，馬力*

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

四川泡菜鹽鹵中微生物總基因組DNA提取方法的比較

蔣云露，楊建濤，王猛，羅軍，蔣倩，姜露熙，張琴，饒瑜，馬力*

（西華大學生物工程學院，四川成都610039）

了得到較高質(zhì)量的基因組脫氧核糖核酸（DNA），本實驗采取了5種方法對四川泡菜鹽鹵總基因組進行提取，對其提取的濃度、純度進行分析比較，并以此為模版進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體外擴增。結(jié)果表明，F(xiàn)1所得的基因組DNA純度及濃度最高，F(xiàn)4方法提取的基因組DNA濃度較高，但受到蛋白或酚類物質(zhì)的污染，F(xiàn)2以及F5兩種方法得到的基因組DNA濃度較低，F(xiàn)3所得的基因組DNA濃度低并且含有較多RNA雜質(zhì)。因此，本研究采用的5種對四川泡菜鹽鹵進行總基因組提取方法中，方法F1最合理、高效。

四川泡菜；基因組；提??；比較

四川泡菜是一類以新鮮蔬菜為原料，在一定濃度的鹽溶液中，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)食品。以乳酸菌為主的微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生風味物質(zhì)，賦予四川泡菜色、香、味及健康因子[1-2]。研究發(fā)酵過程中的微生物種類和動態(tài)變化有助于了解四川泡菜的發(fā)酵及其風味形成規(guī)律。利用傳統(tǒng)的實驗室微生物分離培養(yǎng)方法，由于環(huán)境的復(fù)雜性和培養(yǎng)條件的限制，能用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的微生物僅占微生物總數(shù)的1%左右[3]，不能準確及時的反映出某一生態(tài)環(huán)境中微生物的構(gòu)成和變化規(guī)律。目前，以某一生態(tài)環(huán)境中的總基因組為模板，擴增大分子16S/18S rDNA作為一個分子指標，廣泛地應(yīng)用于各種微生物的遺傳特征和分子差異的研究[4]。

目前，提取總基因組的方法很多。研究者嘗試過多種多樣的提取總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的方法，根據(jù)微生物細胞壁裂解方法的不同，主要可分為三大類：（1）物理方法如研磨、高溫、超聲波等。（2）化學方法如高鹽濃度十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）法等。（3）酶裂解法如蛋白酶K、溶菌酶等[5]。根據(jù)實驗?zāi)康牟灰粯樱@幾種方法各有各的優(yōu)缺點。通過物理方法得到的基因組DNA片段往往較小，約5～10 kbp，并且產(chǎn)率較低[6]，不適合普遍應(yīng)用。化學方法和酶裂解法，目前應(yīng)用得比較多，但是仍然存在缺點，即是較難獲得大片段DNA，一般小于700 kbp[7]。此外還有各種有針對性的試劑盒用于不同樣品總基因組的提取。

之前有研究報道，稱土壤中存在的腐殖酸等抑制因素可以干擾裂解、降解微生物DNA使后續(xù)反應(yīng)酶失活，使其DNA的提取具有一定難度[8-10]。四川泡菜中具有較復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，鹽濃度和植物腐殖質(zhì)都會對其中微生物基因組的提取和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增造成影響。本研究采用快速提取法以及4種不同DNA提取試劑盒進行實驗對比，分別提取四川泡菜鹽鹵中的微生物總基因組，比較其產(chǎn)物的濃度及純度。然后進行16S rDNA PCR體外擴增，對比不同方法提取的DNA進行PCR體外擴增的成功率。從而分析得出提取泡菜鹽鹵總基因組質(zhì)量最好的方法。為四川泡菜發(fā)酵及腐敗過程中微生物區(qū)系的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青菜：購于成都某菜市場；將新鮮青菜洗凈晾干后，取800 g放入加有1 500 mL鹽質(zhì)量濃度為6 g/100 mL鹽鹵的泡菜壇中，在壇沿加水密封。靜置發(fā)酵3個月。

提取緩沖液（extraction buffer）、酚-氯仿-異戊醇體積比（25∶24∶1）、無水乙醇、體積分數(shù)為70%乙醇：成都科龍試劑廠；酸洗玻璃珠、100 μg/mL核糖核酸酶A（RNase A）：美國Sigma公司；土壤DNA提取試劑盒、水樣DNA提取試劑盒：成都福際生物公司；土壤DNA提取試劑盒、水樣DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTIFUGE X1R臺式冷凍離心機：美國BECKMAN公司；Eppendorf AG22331 PCR儀、T2A凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂BIO-RAD公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；SYQ-DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-2600分光光度計：德國EPPENDORF公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣

用移液管移取40mL鹽鹵于50mL離心管中，6000r/min離心15 min，去除上清液，重復(fù)3次。沉淀用1.5 mL無菌蒸餾水沖洗管壁，將液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，8 000 r/min離心1 min，棄上清，向2 mL離心管中加入1.5 mL無菌蒸餾水，漩渦振蕩使沉淀重懸，8 000 r/min離心1 min，棄上清。重復(fù)3次以去除雜質(zhì)，得到干凈的菌體沉淀。

1.3.2 總基因組DNA的提取

快速提取法提取總基因組DNA：將1.3.1中得到的沉淀重懸于200 μL提取緩沖液（extraction buffer）中，同時加入200 μL酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）、0.3 g酸洗玻璃珠，漩渦振蕩3 min，10 000 r/min條件下離心5 min，取上清重復(fù)3次。向離心管中加入所取上清體積2倍的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃、30 min沉淀核酸。10 000 r/min條件下離心5 min，棄上清。向離心管中加入1 mL體積分數(shù)為70%乙醇，上下顛倒數(shù)次，10 000 r/min條件下離心2 min，去上清，沉淀置于37℃、20 min烘干，然后重懸于50 μL 100 μg/mL RNase A中，37℃水浴30 min后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4種不同DNA提取試劑盒提取總基因組的DNA方法：參考各DNA提取試劑盒說明書進行。

1.3.3 檢測基因組DNA的純度與濃度

各種方法提取得到的總基因組的DNA，各取5 μL于1.0%瓊脂糖凝膠，100 V電泳40 min，凝膠成像儀下觀察其條帶直觀檢測其DNA濃度。此外，通過紫外分光光度計分別測定這五種方法提取的基因組DNA在260 nm，280 nm處的吸光度值OD260nm、OD280nm。并根據(jù)OD260nm/OD280nm計算其基因組DNA純度[11-12]。純DNA的OD260nm/OD280nm值為1.80，大于或小于這個值的樣品DNA都分別受到RNA或蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)的污染。OD260nm=50 ng/μg計算基因組DNA原液的濃度，因此基因組DNA濃度計算公式如下：

式中：[dsDNA]是所提基因組DNA濃度，ng/μL；OD260nm是DNA在波長260 nm處的吸光度值。

1.3.4 16S rDNA PCR體外擴增

為了進一步檢測細菌基因組DNA的質(zhì)量，將所提取總基因組作為模版，以Eu27F和1490R引物。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，進行16S rDNA片段的體外擴增。將擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。有關(guān)引物序列見表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳檢測檢測基因組DNA

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測各種方法提取的基因組DNA樣品，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，F(xiàn)1、F2基因組條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象。F3基因組條帶模糊，有一定拖尾現(xiàn)象，說明所提取的基因組中可能出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者是混有較多的核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）[14]。F4、F5基因組條帶清晰，但是亮度較弱，說明所提取的基因組濃度較低。

2.2 基因組DNA的純度與濃度

基因組純度和濃度的測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，F(xiàn)1的基因組DNA的質(zhì)量濃度最高為30.0 ng/μL，F(xiàn)4次之為27.0ng/μL，F(xiàn)3的基因組DNA質(zhì)量濃度最低為13.6ng/μL。從圖2中OD260nm/OD280nm的比值分析基因組DNA純度結(jié)果可知，F(xiàn)1的基因組DNA純度最高，而F3和F4的基因組DNA純度相對較低。F3的OD260nm/OD280nm值為1.91，較純DNA的OD260nm/OD280nm值1.80高出0.11，說明該基因組DNA中混有RNA雜質(zhì)。F4的OD260nm/OD280nm值為1.71，較純DNA的OD260nm/ OD280nm值1.80偏低，說明該基因組DNA受到蛋白或酚類物質(zhì)的污染。

2.3 PCR擴增檢測各基因組的質(zhì)量

以5種方法提取的基因組為模版，進行16S rDNA PCR擴增，擴增結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，利用快速提取法提取基因組為模版進行16S rDNA PCR擴增，1泳道無條帶，因此擴增失敗，而2、3、4、5泳道均成功。說明F3基因組濃度過低，且含較多雜質(zhì)。F1與F2基因組PCR條帶清晰明亮，說明F1與F2基因組濃度較高且含雜質(zhì)較少，F(xiàn)4及F5基因組PCR條帶清晰，但亮度較弱，說明F2及F5基因組濃度較低或者純度不高，含有雜質(zhì)。

3 結(jié)論

DNA提取是裂解細胞膜、細胞核后提取核酸、去除蛋白質(zhì)、脂類和多糖等物質(zhì)的過程，作為一種常規(guī)技術(shù)在分子生物學研究中發(fā)揮著舉足輕重的作用[15]。

四川泡菜鹽鹵組成較為復(fù)雜，含有各種離子、腐殖質(zhì)、有機酸、無機鹽等，因此對其進行基因組提取較為困難，以提取得到基因組作為模版進行后續(xù)操作的結(jié)果也不太理想。因此本研究對5種不同方法提取四川泡菜鹽鹵基因組DNA結(jié)果進行分析比較，得出F1方法提取得到的基因組DNA濃度和純度均最高，并且在后續(xù)PCR擴增檢測中條帶清晰。F4方法提取的基因組DNA濃度較高，但受到蛋白或酚類物質(zhì)的污染，需對所得基因組DNA進一步純化。F2和F5兩種方法得到的基因組DNA濃度較低，且純度也不高。F3所得的基因組DNA濃度低并且含有較多RNA雜質(zhì)。因此，用成都福際生物公司的土壤DNA提取試劑盒來提取四川泡菜鹽鹵總基因組相對而言較為合理，可為后續(xù)實驗提供質(zhì)量較高的基因組DNA。

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JIANG Yunlu,YANG Jiantao,WANG Meng,LUO Jun,JIANG Qian,JIANG Luxi,ZHANG Qin,RAO Yu,MA Li*
(School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

In order to get high quality genomic DNA,the total genomic was extracted from Sichuan pickled vegetables broth by five methods,and the purity and concentration of DNA products were compared and analyzed.The genomic DNA was then used as templates for PCR amplification.The results showed that the quality of DNA extracted by method F1 had the highest concentration and purity,the genomic DNA extracted by F4 was with high concentration but contaminated with protein or phenols.The genomic DNA extracted by F2,F5 and F3 had low concentration,and the genomic DNA extracted by F3 had RNA impurity.In conclusion,method F1 was the optimal method for genomic DNA extraction from Sichuan pickled vegetable samples.

Sichuan pickled vegetables;genomic;extraction;comparison

TS255.1

A

0254-5071（2015）04-0090-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.020

2015-03-17

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410623008）；西華大學重點實驗室開放項目（szjj2013-047）

蔣云露（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品安全。

*通訊作者：馬力（1956-），男，教授，本科，研究方向為食品微生物。