【作 者】韓昭昭

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京市，100044

基于第二代測序技術(shù)的胎兒染色體非整倍體檢測試劑申報資料要求

【作 者】韓昭昭

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京市，100044

該文旨在闡述基于第二代測序技術(shù)的胎兒染色體非整倍體檢測試劑的申報情況及檢測試劑注冊申報資料的技術(shù)要求。通過介紹該類試劑的申報情況，分析該類試劑的注冊申報資料中常見問題，對檢測試劑的預期用途、參考品和質(zhì)控品的設置、分析性能評估、參考區(qū)間的研究及臨床評價等部分注冊申報資料要求進行解析。

第二代測序技術(shù)；注冊申報；分析性能；技術(shù)審評；臨床評價

染色體疾病是由于先天性染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常而引起的具有一系列臨床癥狀的綜合征，表現(xiàn)為先天性智力低下，生長遲緩及多發(fā)畸形等。染色體病約有數(shù)百種，其中最常見的有60多種。在自然流產(chǎn)胎兒中有20%～50%是由染色體異常引起；在新生活嬰中染色體異常的發(fā)生率為0.5%～1%[1]，其中21-三體綜合征（唐氏綜合征）、18-三體綜合征（愛德華氏綜合征）和13-三體綜合征（帕陶氏綜合征）是三種最主要的染色體疾病。我國目前每年有數(shù)萬例染色體異?；純海ê喜⒏鞣N異常和畸形）出生，大大降低了人群健康水平和人口素質(zhì)，且因治療、殘疾和死亡導致的疾病給社會帶來了巨大的負擔。有效的產(chǎn)前診斷可以降低圍生兒的死亡率，且可以通過對出生缺陷患兒的早期干預，明顯改善生存質(zhì)量。

目前主要通過對母血中甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素β亞基、游離雌三醇等多生化指標聯(lián)合檢測對胎兒染色體病進行篩查，染色體核型分析為確診的染色體病的主要方法[2-3]。染色體核型分析為侵入性產(chǎn)前診斷，主要采用細胞培養(yǎng)和染色體G顯帶分析，這種方法存在由于細胞培養(yǎng)失敗、細胞生長較差、染色體可分析核型過少或形態(tài)較差，造成核型分析失敗的情況和導致流產(chǎn)及胎兒肢體畸形風險。母體血漿中存在的胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)和高通量測序平臺的誕生，為對傳統(tǒng)侵入性產(chǎn)前檢測有疑慮或風險不可接受的高危孕婦提供了一種新的選擇。

1 注冊申報情況

2014年6月30日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局，批準了首批第二代基因測序診斷產(chǎn)品，包含兩個基因測序儀和兩個配套胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒。之后有多家公司進行同類儀器及配套試劑的注冊申報并陸續(xù)批準上市。第二代基因測序?qū)儆谖⒀h(huán)陣列合成測序，采用大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)，利用DNA聚合酶或連接酶及引物對末班進行一系列的延伸，通過顯微技術(shù)觀察記錄連續(xù)循環(huán)中的光學信號來實現(xiàn)測序，可以同時并行分析陣列上的DNA樣本[4]。就目前申報及已批準上市的第二代測序產(chǎn)品來說，胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒的配套儀器主要為各申報單位基于Illumina公司和AB Life Technologies公司技術(shù)自行生產(chǎn)的第二代測序平臺。

由于第二代測序技術(shù)相對其他檢測技術(shù)問世時間較短，技術(shù)較為復雜，因此對于本類檢測試劑而言，

目前要求試劑申請需在配套儀器批準上市后進行，或試劑與配套儀器同時進行注冊申報。目前國際主流的第二代測序平臺還未在國內(nèi)批準上市，甚至未在原產(chǎn)國批準上市，因此限制了大批國內(nèi)試劑生產(chǎn)商的申報，預計將來主流第二代測序平臺上市后，會有大量的相關(guān)檢測試劑進行注冊申報。

2 預期用途

根據(jù)目前國內(nèi)和國際的普遍認知[5]，建議將本類試劑的預期用途定義為：用于定性檢測孕婦外周血漿中胎兒游離脫氧核糖核酸（cell-free fetal DNA, cffDNA）。通過分析樣本胎兒游離DNA的染色體數(shù)量的差異，對胎兒染色體非整倍體疾病進行產(chǎn)前輔助診斷。由于目前該類檢測并未在所有人群中進行充分的評估，因此目標人群應僅限于高危、單胎孕婦。高危孕婦的定義參考相關(guān)衛(wèi)生行業(yè)標準[2-3]。另外還需結(jié)合胎兒cffDNA濃度規(guī)律及目前常規(guī)產(chǎn)前診斷的標準日程安排，明確對待檢孕婦孕周的要求。

3 參考品和質(zhì)控品的設置

本類檢測試劑項目目前已有國家參考品（高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體T21、T18和T13），根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》規(guī)定，申報注冊產(chǎn)品在臨床評價前應采用國家參考品進行注冊檢測。然而注冊檢測不能有效控制每批產(chǎn)品的質(zhì)量，因此企業(yè)還需重視對企業(yè)內(nèi)部參考品的建立，建議企業(yè)參考國家設置項目設置內(nèi)部參考品，至少包含陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復性質(zhì)控品。其中陽性參考品和重復性參考品應包含特定濃度的T13、T18、T21陽性參考品，陰性參考品除正常孕婦血漿游離DNA外，還應包含其他染色體非整倍體參考品。

建議在試劑盒中配置合理的質(zhì)控品以確保檢測結(jié)果有效可靠。對于本類檢測項目由于發(fā)病率較低，同一檢測中樣本檢出全部為陽性的概率極低，此時同一檢測中的正常樣本可起到陰性對照的作用，因此對于本類檢測試劑，試劑盒中可僅設置陽性質(zhì)控品。為更好的監(jiān)控檢測體系，陽性質(zhì)控品建議設置為弱陽性濃度水平，且包含全部三種待測三體異常樣本，質(zhì)控品可以三只單獨或三種混合的形式包裝。

4 分析性能評估

分析性能評估資料是注冊申報資料的重要技術(shù)資料，申請企業(yè)應詳細編寫此部分內(nèi)容，對于本類產(chǎn)品除常規(guī)的評估項目外，還應包括以下內(nèi)容：

(1) 對提取試劑的驗證，其中至少包含提取效率、提取重復性及提取抗干擾能力的研究；

(2) 對企業(yè)內(nèi)部參考品的檢測、對微缺失微重復和嵌合體樣本的檢測、對異位樣本的檢測；

(3) 內(nèi)源性物質(zhì)的定量干擾試驗；(4) 胎兒DNA樣本含量的研究；(5) 測序Reads量的研究資料。

5 參考區(qū)間的研究

采用大樣本量的正常女性孕婦血漿游離DNA進行參考區(qū)間研究，樣本應有明確的臨床檢測結(jié)果及清晰的來源。計算陰性樣本的Z值，并根據(jù)樣本分布情況選擇合理的統(tǒng)計學方法，計算參考區(qū)間。選擇一定數(shù)量經(jīng)確認的T13、T18和T21陽性血漿DNA臨床樣本對參考范圍的進行驗證，驗證參考區(qū)間的合理性。對落入?yún)⒖紖^(qū)間內(nèi)可能出現(xiàn)的陽性情況進行討論；給出合理的灰區(qū)范圍并對檢測出現(xiàn)灰區(qū)樣本的處理方法進行合理的建議。

對于本類產(chǎn)品Z值并非直接檢測得出數(shù)值，它是一個計算比值，是檢測樣本中特定染色體比例與參考人群特定染色體比例平均值的標準偏差。其中參考人群中特定染色體的比例平均值及對應的染色體比例標準偏差，是由各個生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)前期研究制定的，因此還需要在參考區(qū)間的研究資料中對這部分研究進行詳細的闡述。

6 臨床評價

鑒于三體綜合征的發(fā)病率相對較低，建議臨床評價總例數(shù)應不少于10 000例，其中包括回顧性研究8 000例、前瞻性研究2 000例。樣本入組標準以及診斷標準依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的WS 322.2-2010《胎兒染色體產(chǎn)前診斷技術(shù)標準》進行，以羊水穿刺核型分析和/或出生隨訪結(jié)果作為對照金標準?；仡櫺匝芯渴侵笇εR床研究單位樣本庫中已有金標準確認的樣本，使用該檢測系統(tǒng)進行重新檢測，其結(jié)果與原金標準結(jié)果進行對比分析。前瞻性研究是指對臨床需要正常進行產(chǎn)前診斷的高危孕婦采集樣本中的樣本與金標準檢測進行對比分析，要求應能檢測出T13陽性病例，檢測出至少5例T18陽性病例以及有具有統(tǒng)計學意義例數(shù)的T21陽性病例。如進行前瞻研究的2 000例之中未出現(xiàn)規(guī)定例數(shù)的陽性病例，則應繼續(xù)增加樣本例數(shù)直至符合最低例數(shù)樣本要求。

對于臨床試驗中由于核型分析的細胞培養(yǎng)不出導致金標準檢測數(shù)據(jù)缺失進而造成數(shù)據(jù)失訪時，失訪率

應控制在≤5%，且失訪數(shù)據(jù)應說明原因。

檢測試劑的臨床評價資料中，回顧性樣本大多以跟蹤隨訪為金標準方法，然而隨訪研究中存在規(guī)范性較差，且各家醫(yī)院方案不同的現(xiàn)象。鑒于目前我國新生兒出生隨訪無權(quán)威的方案與規(guī)范，建議臨床評價采用出生隨訪作為回顧研究金標準方法的研究者，臨床評價前協(xié)調(diào)所有臨床試驗機構(gòu)，制定清晰、合理統(tǒng)一的臨床試驗方案，使得臨床評價更加科學合理。

基于第二代測序技術(shù)的胎兒染色體非整倍體檢測為那些對傳統(tǒng)有創(chuàng)產(chǎn)前檢測有疑慮或認為風險不可接受的孕婦的產(chǎn)前診斷提供了新的選擇。此類檢測試劑的臨床定位應建立在充分的研究實踐基礎上，性能評估應結(jié)合產(chǎn)品的特性進行。另外申報企業(yè)應重視對檢測試劑企業(yè)內(nèi)部參考品和試劑盒內(nèi)質(zhì)控品的設置；建議選擇大量樣本利用合理的統(tǒng)計學方法設置參考區(qū)間。臨床評價應選擇目標人群進行，并對一定數(shù)量的前瞻樣本進行研究。本文僅針對此類試劑盒的部分申報資料提出建議，目前該類產(chǎn)品的申報數(shù)目較少，審評經(jīng)驗不足，隨著該類產(chǎn)品的發(fā)展以及管理法規(guī)的建立和完善，對此類試劑臨床試驗研究的要求將更加合理可行。

[1] 陳竺. 醫(yī)學遺傳學[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部. WS 322.1—2010 胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準 第1部分: 中孕期母血清學產(chǎn)前篩查[S].

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部. WS 322.2—2010 胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準 第2部分:胎兒常見染色體異常的細胞遺傳學診斷技術(shù)標準[S].

[4] 周曉光, 任魯鳳, 李運濤, 等. 下一代測序技術(shù):技術(shù)回顧與展望[J].中國科學:生命科學, 2010, 40(1): 23-37.

[5] The American college of obstetricians and gynecologists committee on genetics, the society for maternal-fetal medicine publications committee. Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy[S]. 2012.

共聚聚酯應用互動技術(shù)平臺Tritan Mold It

近年來，美國伊士曼化工公司推出新一代共聚聚酯 ——TritanTM。由于它具有優(yōu)良的機械物理性能，如高抗沖擊強度；優(yōu)良的耐化學性，不含BPA，良好的生物相容性；高透明度與良好的加工成型性。自推出市場以來，已經(jīng)在家居用品、小家電中的耐用品以及醫(yī)療器械（留置針、透析器）等領域得到廣泛應用。

然而，TritanTM材料在加工工藝與模具設計方面有一定的特殊要求，為了幫助用戶順利地采用TritanTM材料來開發(fā)各種品質(zhì)優(yōu)良的產(chǎn)品，快速地掌握TritanTM的特性與加工工藝，日前伊士曼公司推出的Tritan Mold It在線互動技術(shù)平臺（www. tritanmoldit.com）。這是一個專為注塑商所提供的資源共享平臺，以協(xié)助伊士曼公司的客戶快速開發(fā)新產(chǎn)品。注塑企業(yè)可以通過該平臺找到豐富的Tritan產(chǎn)品技術(shù)資料和加工指南，并在網(wǎng)站的論壇版塊分享注塑經(jīng)驗。Tritan Mold It 特別設有“向?qū)＜姨釂枴睓谀浚岢龅募夹g(shù)問題將在24小時內(nèi)得到回復。

Tritan Mold It是一個面向采用伊士曼公司TritanTM共聚聚酯材料的注塑企業(yè)的互動在線平臺，共有中、英、日、韓四種語言。它可在線幫助注塑商深入地了解如何加工TritanTM材料：如何優(yōu)化加工設備，盡可能降低使用模具加工TritanTM材料的難度，生產(chǎn)出能夠滿足客戶需求的產(chǎn)品。同時幫助用戶提高流程效率，降低能耗和廢品率，從而提高經(jīng)濟效益。

（本刊訊）

Ideas about Registration for Prenatal Diagnosis of Chromosome Aneuploidy by Next Generation Sequencing Technology

【W(wǎng)riter】HAN Zhaozhao
Center for Medical Device Evaluation, CFDA, Beijing, 100044

To review the registration and technical data for prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy by next generation sequencing technology. On the basis of introducing declarations of the reagents, analysis registration dossier common problems. And analysis the requirement of performance evaluation, reference intervals and clinical evaluation study.

next generation sequencing, registration, evaluation performance, technical review, clinical evaluation

F203

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.03.015

1671-7104(2015)03-0209-03

2015-02-03

韓昭昭，E-mai: phemily@126.com