王曉卉，李 翠，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時(shí)

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

動(dòng)物試驗(yàn)替代方法在獸用疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用概況

王曉卉，李 翠，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時(shí)?

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

介紹了動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的含義及其在國內(nèi)外的發(fā)展情況，并從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法、血清學(xué)替代法和疫苗抗原定量法三方面重點(diǎn)介紹了動(dòng)物試驗(yàn)替代方法在獸用疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用情況、優(yōu)勢和意義，以期為獸用疫苗檢驗(yàn)替代方法研究提供參考。

動(dòng)物試驗(yàn)替代方法；獸用疫苗檢驗(yàn)

1 動(dòng)物試驗(yàn)替代方法概述

1959年，在英國動(dòng)物學(xué)家William與Rex共同出版的專著《The Principles of Humane Experimental Technique》中，最早提出了減少（Reduction）、替代（Replacement）、優(yōu)化（Refinement）（簡稱 3R）原則［1］，其具體的含義為：減少科學(xué)研究活動(dòng)中的動(dòng)物使用量，探索能夠達(dá)到相同目的或獲得相同結(jié)果的動(dòng)物試驗(yàn)替代方法，采用一切可行的技術(shù)和手段，使動(dòng)物免受試驗(yàn)所造成的痛苦、不安和疼痛或／和改善生活環(huán)境，從而提高動(dòng)物生存質(zhì)量的優(yōu)化方法［2］。1978年，David Smyth教授出版了《動(dòng)物試驗(yàn)替代方法（Alternatives to Animal Experiments）》一書，提出用替代（Alternatives）來給3R做了概括［3］。3R是現(xiàn)今動(dòng)物試驗(yàn)替代方法（Alternative Methods）的核心和主要研究內(nèi)容，是動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的發(fā)展方向，有時(shí)就是替代試驗(yàn)代名詞［4］。

為了推動(dòng)動(dòng)物替代技術(shù)的發(fā)展，國外成立了許多相關(guān)的研究組織和管理機(jī)構(gòu)，并投入大量經(jīng)費(fèi)資助相關(guān)的科學(xué)研究，以促進(jìn)新技術(shù)新方法的開發(fā)和應(yīng)用，如美國霍普金斯動(dòng)物試驗(yàn)替代方法研究中心（The Johns Hopkins center for Alternatives to Animal Testing，CAAT）、歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European center forthe validation ofalternative methods，ECVAM）、美國機(jī)構(gòu)間替代方法評價(jià)協(xié)調(diào)委員會（The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Method，ICCVAM）等等。除了設(shè)立機(jī)構(gòu)之外，許多國家還都制定了動(dòng)物保護(hù)相關(guān)法規(guī)或發(fā)布管理?xiàng)l例、行業(yè)規(guī)范對動(dòng)物試驗(yàn)予以約束。如1876年英國頒布的世界上第一部涉及有動(dòng)物試驗(yàn)內(nèi)容的法規(guī)《防止虐待動(dòng)物法》［3］，美國《動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品法》和《人道主義飼養(yǎng)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的公共衛(wèi)生方針》也明確規(guī)定了3R原則在動(dòng)物試驗(yàn)方面的應(yīng)用［5］。

我國動(dòng)物福利起步較晚，與國外相比，我國在這方面差距較大，但目前也正在逐步與國際接軌。1997年，原國家科委等四部委聯(lián)合發(fā)布的《關(guān)于“九五”期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展的若干意見》，是第一次把3Rs的基本概念寫進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作管理和科技發(fā)展的法規(guī)性文件，并把“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代研究”列為“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)性研究”的重點(diǎn)內(nèi)容［6］。2001年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《科研條件建設(shè)“十五”發(fā)展綱要》中，明確提出“推動(dòng)建立與國際接軌的動(dòng)物福利保障制度”，并把這一工作納入“全面推行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法制化管理”的重要內(nèi)容之一［7］。2006年我國發(fā)布《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，首次對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利提出指導(dǎo)性意見。我國也于2006年首先建立了中國替代方法研究評價(jià)中心（Chinese Center for Alternatives Research＆Evaluation，CCARE），旨在為中國的替代方法研究提供信息交流、法規(guī)介紹和技術(shù)服務(wù)的平臺，并于2007年開通了中國替代方法研究評價(jià)中心共識平臺（www.vitrotox.com），通過這個(gè)平臺有效推動(dòng)了“3R”原則的社會認(rèn)知、推進(jìn)替代方法的研究和技術(shù)進(jìn)步、實(shí)現(xiàn)資源的共享和信息自由交流［8］。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所也已于2013年8月起開始實(shí)施對動(dòng)物試驗(yàn)的動(dòng)物福利倫理審查申請程序。

隨著動(dòng)物福利受到愈加廣泛的關(guān)注，國內(nèi)外關(guān)于動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的研究也越來越多，主要研究領(lǐng)域有：化學(xué)品的毒理性研究；藥物和疫苗產(chǎn)品的研發(fā)、評價(jià)和質(zhì)量控制；食品中化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性、致癌性的監(jiān)管評估；化妝品的安全評價(jià)［9］。

3R原則受到了普遍關(guān)注，加強(qiáng)動(dòng)物試驗(yàn)替代方法研究也已成為生命科學(xué)工作者的共識。許多專家強(qiáng)調(diào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其相關(guān)研究是一項(xiàng)基礎(chǔ)性強(qiáng)、高新技術(shù)密集的研究領(lǐng)域，其發(fā)展和應(yīng)用程度已成為衡量一個(gè)國家或地區(qū)科學(xué)技術(shù)水平高低的重要標(biāo)志之一，我國的科學(xué)研究、新醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域要走在世界前沿，就要重視和開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究，加強(qiáng)動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的研究［10］。

2 動(dòng)物試驗(yàn)替代方法在獸用疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用

疫苗接種是預(yù)防和控制傳染病的重要武器，自人類發(fā)現(xiàn)疫苗的免疫作用至今，疫苗為人類和動(dòng)物的健康做出了重要貢獻(xiàn)。獸用疫苗可以預(yù)防動(dòng)物免受許多傳染性疾病的侵害，更重要的是，獸用疫苗通過對一些人畜共患病的防控，對人類健康的貢獻(xiàn)也不可小覷，如獸用狂犬病疫苗。同時(shí)，獸用疫苗還是預(yù)防一些外來病的重要手段，如口蹄疫、新型流感病毒等［11］。合格的疫苗一定要滿足安全性、有效性的基本要求，這就決定了疫苗必須經(jīng)過安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。然而，在獸用疫苗的質(zhì)量評價(jià)中，尤其是在評價(jià)獸用疫苗免疫效力的各種方法中，基于免疫學(xué)原理的動(dòng)物免疫攻毒法等動(dòng)物試驗(yàn)法仍然是最令人信服的獸用疫苗免疫效力評價(jià)方法，即動(dòng)物試驗(yàn)很大程度上在獸用疫苗的免疫評價(jià)中仍發(fā)揮著不可替代的作用。但對于獸用疫苗檢驗(yàn)中所用動(dòng)物種類多、數(shù)量大的情況，動(dòng)物試驗(yàn)法檢驗(yàn)疫苗效力存在很多問題，主要有：動(dòng)物（尤其是一些大動(dòng)物和特殊動(dòng)物）供應(yīng)不足；動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)不完善，監(jiān)管不到位，質(zhì)量得不到保證；動(dòng)物試驗(yàn)過于頻繁，動(dòng)物福利未得到有效關(guān)注［12］。

國內(nèi)外一直在努力探索應(yīng)用替代方法檢驗(yàn)獸用疫苗的質(zhì)量，也取得了許多成果。目前，對于活疫苗的效力檢驗(yàn)已廣泛應(yīng)用了替代方法，也有一些滅活苗應(yīng)用了替代方法進(jìn)行檢驗(yàn)，大大降低了疫苗檢驗(yàn)的成本和效率。迄今為止，應(yīng)用較多的替代方法主要有：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法、血清學(xué)替代法和疫苗抗原定量法。

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法 用于獸用疫苗檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，一些小型動(dòng)物，如雞、鼠、兔等的供應(yīng)較為充足，且易于獲得符合試驗(yàn)要求的動(dòng)物。但一些較大的動(dòng)物，如豬、馬、牛、羊等，和一些特殊動(dòng)物，如貂、狐等的供應(yīng)較難滿足試驗(yàn)需要，且往往需要實(shí)驗(yàn)人員到養(yǎng)殖場甚至是散養(yǎng)戶去一一篩選符合試驗(yàn)要求的陰性動(dòng)物。嚴(yán)格意義上，這樣的動(dòng)物其實(shí)已不能稱之為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而且由于國家對一些重大動(dòng)物疫病實(shí)行強(qiáng)制免疫政策，篩選符合某些要求的陰性動(dòng)物較有難度，如豬藍(lán)耳病抗體陰性豬。因此，很多疫苗在檢驗(yàn)中尋找了小型動(dòng)物與本動(dòng)物之間的平行關(guān)系，并用小型動(dòng)物替代本動(dòng)物進(jìn)行檢驗(yàn)，以節(jié)約成本，降低難度，也響應(yīng)了3R原則中的“減少”要求。如豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗(yàn)，應(yīng)用兔體定型熱法進(jìn)行，替代了用陰性豬進(jìn)行的強(qiáng)毒攻擊，在提高檢驗(yàn)效率的同時(shí)，也減少了強(qiáng)毒污染帶來的安全隱患。再如豬圓環(huán)病毒 2型滅活苗（SH株）的效力檢驗(yàn)，應(yīng)用小鼠免疫試驗(yàn)法，既替代了攻毒試驗(yàn)，也替代了豬的使用，解決了實(shí)際檢驗(yàn)中圓環(huán)陰性豬篩選難的問題［13］。除此以外，雞新城疫活疫苗、雞痘活疫苗等采用雞胚檢驗(yàn)法替代雞檢法也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法的應(yīng)用。雖然在獸藥典中，很多應(yīng)用了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法進(jìn)行效力檢驗(yàn)的產(chǎn)品，本動(dòng)物免疫攻毒法仍作為備選方法之一列出［14］，但在實(shí)際中已很少應(yīng)用。

2.2 血清學(xué)替代法 對于許多滅活苗成品效力檢驗(yàn)，由于經(jīng)過滅活加之佐劑的干擾，很難像活疫苗那樣用半數(shù)感染量等方法進(jìn)行抗原滴度的測定，因此，許多滅活疫苗不得不使用本動(dòng)物攻毒法檢驗(yàn)效力。而攻毒法無法做到動(dòng)物福利的要求，而且需要試驗(yàn)和飼養(yǎng)場所嚴(yán)格防護(hù)，并嚴(yán)格處理動(dòng)物排泄物、尸體等，從各個(gè)環(huán)節(jié)防止病原污染環(huán)境帶來安全隱患。因此，一些滅活苗產(chǎn)品采用了血清學(xué)方法作為替代方法，即用疫苗免疫動(dòng)物后，采集免疫血清，測定其中的特異性抗體滴度，以滴度的高低作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。該方法減少了病毒擴(kuò)散的危險(xiǎn)，消除了攻毒給動(dòng)物帶來的痛苦，還節(jié)省了時(shí)間。從疫苗監(jiān)控上看，該方法還將攻毒試驗(yàn)的“定性”判定（死亡或出現(xiàn)臨床癥狀），轉(zhuǎn)向了“定量”判定，更加準(zhǔn)確，還可以將血清樣品冷凍保存，方便復(fù)檢［15］?？梢?，血清學(xué)替代法體現(xiàn)了3R原則的“優(yōu)化”要求。如雞新城疫、減蛋綜合征二聯(lián)滅活疫苗，該疫苗中的兩種抗原均用血清學(xué)方法，測定免疫雞血清中的HI抗體效價(jià)來檢驗(yàn)疫苗效力［14］。

2.3 疫苗抗原定量法 對于疫苗來說，無論活疫苗還是滅活疫苗，其效力的最終決定因素都是其中抗原的含量。在活疫苗的效力檢驗(yàn)中，通過在體外對抗原進(jìn)行定量來評價(jià)疫苗質(zhì)量的方法，已經(jīng)很大程度上替代了免疫攻毒法，常用的方法有：利用微量細(xì)胞培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變（CPE），計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)物的半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量（TCID50），如豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗；對于不致細(xì)胞病變的抗原，可利用免疫熒光技術(shù)，計(jì)算半數(shù)感染量（FAID50）；利用某些病毒可在細(xì)胞單層上形成蝕斑的特性，通過蝕斑計(jì)數(shù)計(jì)算疫苗的蝕斑形成單位數(shù)（PFU），如雞馬立克氏病活疫苗；對于有的細(xì)菌活疫苗，可通過活菌計(jì)數(shù)計(jì)算菌落形成單位數(shù)（CFU），如布氏桿菌病活疫苗［14］。這些試驗(yàn)常常用到Reed－Muench法或Karber法進(jìn)行定量，并建立了與傳統(tǒng)動(dòng)物檢驗(yàn)法的相關(guān)性，且在質(zhì)量控制中通常保留一定的緩沖范圍，以盡量減小檢驗(yàn)誤差和疫苗保存期間的效力損失，在美國，這一緩沖范圍通常分別為100.7TCID50和100.5TCID50［16］。疫苗抗原定量法的優(yōu)點(diǎn)是不言而喻的，它最大程度的擺脫了動(dòng)物試驗(yàn)的束縛，大大節(jié)約了檢驗(yàn)成本、縮短了試驗(yàn)時(shí)間、并避免了動(dòng)物個(gè)體差異造成的誤差，同時(shí)也完全實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物福利3R原則的“替代”要求。

然而，對于滅活苗的成品效力檢驗(yàn)，以上方法就難以勝任了，只能在滅活前對其進(jìn)行抗原定量。由于滅活苗經(jīng)過滅活，其免疫效力可以說幾乎完全由抗原含量決定，而不需要像活疫苗那樣依賴抗原活性經(jīng)過一個(gè)體內(nèi)的增殖過程來體現(xiàn)效力。但受活性和佐劑的影響，對滅活苗進(jìn)行準(zhǔn)確的抗原定量仍有一定難度。但仍有一些滅活苗產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了抗原定量法評價(jià)效力，其中，ELISA方法應(yīng)用最為普遍。如美國輝瑞公司生產(chǎn)的豬支原體肺炎滅活疫苗，將疫苗破乳處理后，將水相中的抗原稀釋后包被反應(yīng)板，采用ELISA方法測定疫苗中所含抗原的相對效力單位值［17］；美國勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒活載體滅活疫苗，采用了新型水溶性佐劑，不需破乳處理即可直接利用ELISA方法測定相對效力值［18］。利用ELISA抗原定量方法評價(jià)滅活苗效力離不開參考疫苗的橋梁作用，即參考疫苗經(jīng)過了本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)方法檢驗(yàn)，并與替代方法進(jìn)行了平行關(guān)系分析，其效力值是特異性、免疫原性、抗原含量符合性和其免疫保護(hù)性等生物學(xué)特性綜合反映的結(jié)果，在替代方法中，參考疫苗代表了傳統(tǒng)方法，實(shí)現(xiàn)了效力檢驗(yàn)的等效替代，根據(jù)被檢疫苗與參考疫苗平行對比檢驗(yàn)后，經(jīng)計(jì)算而形成相關(guān)效力單位值（RF值），對被檢疫苗的抗原含量、免疫抗體效價(jià)和保護(hù)效力是否符合法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)予以評價(jià)和判定［19］。美國更是在其獸醫(yī)局規(guī)章中規(guī)定了進(jìn)行滅活獸用生物制品相關(guān)抗原含量測定的所有體外效力檢驗(yàn)，均應(yīng)采用有效期內(nèi)的參考免疫原制備物來進(jìn)行平行測定或其他能夠證明在平行關(guān)系、特異性和重復(fù)性方面至少與平行測定等同的其他方法進(jìn)行［20］。當(dāng)然，ELISA并不是唯一適用滅活苗抗原定量的檢驗(yàn)方法，如對口蹄疫滅活疫苗，我國農(nóng)業(yè)部已于2014年初制定并發(fā)布了口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測定法及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，利用不同方法對疫苗進(jìn)行破乳取得水相，測定其中內(nèi)毒素含量，并采用Lowry法測定其總蛋白含量［21］。并且農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《關(guān)于做好口蹄疫疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升工作的通知》，在提高口蹄疫滅活苗及合成肽苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，要求相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)結(jié)合自身實(shí)際，盡快組織企業(yè)生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)人員，認(rèn)真學(xué)習(xí)、準(zhǔn)確理解新增檢測參數(shù)，掌握檢驗(yàn)技術(shù)［22］。該方法將逐步取代以牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的PD50測定法，在節(jié)約成本、提高效率的同時(shí)，有利于國家對口蹄疫疫苗的監(jiān)督管理，進(jìn)而大大促進(jìn)口蹄疫防控工作的開展。

在疫苗的抗原定量法檢驗(yàn)疫苗效力的研究中，熒光定量PCR方法也受到了許多研究人員的關(guān)注。熒光定量PCR方法可對抗原的核酸特定片段進(jìn)行快速定量檢測，具有實(shí)時(shí)性、高靈敏度、高通量檢測、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，并能夠以核酸拷貝數(shù)的形式具體、準(zhǔn)確、客觀地顯示抗原的含量。Marsha S Russell等利用熒光定量PCR方法評價(jià)了水痘弱毒活疫苗的效力，并與傳統(tǒng)的蝕斑計(jì)數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行了相關(guān)性分析，證明了兩者之間沒有顯著差異，具有良好的相關(guān)性［23］。陳鍇等也探索了利用熒光定量PCR方法作為豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗(yàn)替代方法的可行性［24］。然而，該方法測得的病毒核酸載量不能直接反映其中正確組裝的病毒粒子數(shù)量［20］，且無法區(qū)分病毒是否具有活性［25］，這些弱點(diǎn)限制了熒光定量PCR方法作為效力檢驗(yàn)替代方法的應(yīng)用。如何正確應(yīng)用該方法測定疫苗的效力，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

應(yīng)用動(dòng)物試驗(yàn)替代方法進(jìn)行獸用疫苗檢驗(yàn)已是許多研究人員的共識，是疫苗檢驗(yàn)工作的必然發(fā)展趨勢。但我國的動(dòng)物試驗(yàn)替代方法研究相比國外發(fā)展緩慢，在獸用疫苗檢驗(yàn)替代方法尤其是體外抗原測定法及參考品的研制和應(yīng)用上相對滯后，不但一些已有的疫苗產(chǎn)品仍在使用傳統(tǒng)方法檢驗(yàn)，一些新研制的疫苗產(chǎn)品也是如此。有些研究人員在探索替代方法時(shí)仍存在一些誤區(qū)，認(rèn)為在檢驗(yàn)疫苗效力時(shí)必須進(jìn)行本動(dòng)物攻毒試驗(yàn)。其實(shí)，建立動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的關(guān)鍵是要建立替代方法和傳統(tǒng)方法的平行關(guān)系，在不同批次產(chǎn)品間進(jìn)行重復(fù)確認(rèn)，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行分析，以保證實(shí)現(xiàn)兩種方法的等效替代，進(jìn)而真正建立起應(yīng)用替代方法檢驗(yàn)疫苗效力的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這就需要相關(guān)研究人員在研發(fā)、申報(bào)新產(chǎn)品時(shí)，除了改善生產(chǎn)工藝，研發(fā)新型疫苗，應(yīng)用新型佐劑以外，要轉(zhuǎn)變觀念，勇于探索替代方法并進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證；相關(guān)監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)也可以通過建立新的指導(dǎo)原則和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來對替代方法研究進(jìn)行引導(dǎo)和鼓勵(lì)。動(dòng)物試驗(yàn)替代方法在疫苗檢驗(yàn)中的普及，在節(jié)約檢驗(yàn)成本、提高檢驗(yàn)效率、保障動(dòng)物福利的同時(shí)，也必將使疫苗的監(jiān)督管理工作更細(xì)化、更及時(shí)，從而促進(jìn)我國動(dòng)物疫病防控工作的開展。

積極向上的大學(xué)校園文化作為一種環(huán)境教育力量，是大學(xué)生精神食糧獲取的重要渠道。通過和諧豐富的校園文化活動(dòng)，吸引年輕有激情的大學(xué)生的注意力，充實(shí)他們的大學(xué)生活，提高生活學(xué)習(xí)質(zhì)量，引導(dǎo)他們樹立健康的人生觀、價(jià)值觀和愛情觀。因此高校應(yīng)立足辦學(xué)特點(diǎn)和校風(fēng)校訓(xùn)，以高尚的健康的校園文化理念來引領(lǐng)校園文化建設(shè)，打造具有本校特色和時(shí)代特征的人文環(huán)境氛圍，讓積極向上的校風(fēng)學(xué)風(fēng)滲透到學(xué)生內(nèi)心，外化于學(xué)生行為，從而推進(jìn)大學(xué)生精神文化建設(shè)，營造健康豐富的內(nèi)心世界。

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［13］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1448號.豬圓環(huán)病毒2型滅活苗（SH株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［Z］.

［14］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部［S］.

［15］趙 俊，李少英，武 華.口蹄疫滅活疫苗效力檢驗(yàn)替代方法研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43（5）：95－98.

［16］Hans Draayer.Overview of currently approved veterinary vaccine potency testing methods and methods in development that do not require animal use［J］.Procedia in Vaccinology，2011，5：171－174.

［17］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1392號.豬支原體肺炎滅活疫苗（P－5722－3株）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［Z］.

［18］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1465號.豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒活載體滅活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［Z］.

［19］United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologics Testing Protocol.SAM318.04.Supplemental assay method for estimating relative potency by the automated selection of line segments in RelPot 4.0 software［Z］.

［20］美國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)服務(wù)局規(guī)章第800.92號.按照聯(lián)邦法規(guī)9CFR113.8對分發(fā)銷售的產(chǎn)品批進(jìn)行體外檢驗(yàn)［Z］.

［21］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2078號.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測定法［Z］.

［22］農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于做好口蹄疫疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升工作的通知［EB／OL］.（2013－06－13）.http：／／www.moa.gov.cn／zwllm／tzgg／tfw／201306／t20130613_3491208.htm.

［23］Marsha S Russell，Changgui Li，Louise Larocque，et al.Rapid and accurate determination of the potency of varicella vaccine by quantitive polymerase chain reaction［J］.Vaccine，2011，29：8490－8495.

［24］陳 鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)檢驗(yàn)替代方法的研究與應(yīng)用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（1）：162－169.

［25］魏 津，蔣 卉，戴志紅，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1－R株）病毒含量熒光定量PCR方法的建立［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，47（10）：39－42.

（編 輯：李文平）

Application of Alternatives to Animal Experiments in the Evaluation of Veterinary Vaccine

WANG Xiao－h(huán)ui，LI Cui，JIANG Hui，ZHANG Xiu－ying，WEN Fang，LU Lian－shou，WANG Zai－shi?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

This review has introduced the alternatives to animal experiments and its development situation at home and abroad.Besides，this paper has provided an overview about the application，advantages and significance of alternatives to animal experiments from three aspects，including the improvement of animal use，the serological assay and the quantification of antigens in the vaccine，so as to offer benefit to the research of the alternatives to animal experiments in the evaluation of veterinary vaccine.

the alternatives to animal experiments；the evaluation of veterinary vaccine

2015－01－16

A

1002－1280（2015）04－0060－05

S859.79

948項(xiàng)目（2011－G14543）；“十二五”科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2013FY113300－3）

王曉卉，碩士研究生，從事獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究。

王在時(shí)。E－mail：wangzaishi＠ivdc.org.cn