劉 瑩，王鳳雪，溫永俊*，武 華

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建，吉林 長春 130112；2.華威特(北京)生物科技有限公司，北京 100085)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種由PRRS 病毒(PRRSV)引起的豬的接觸性傳染病，主要引起母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥等。該病傳播快、傳染性強(qiáng)，被OIE 列入93 種法定報告動物疫病之一。2006 年，我國暴發(fā)了高致病性PRRS(HP-PRRS)，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，許多研究主要集中于揭示PRRSV 引發(fā)疾病的途徑和機(jī)理以及影響毒力的相關(guān)蛋白，本文對PRRSV 的非結(jié)構(gòu)蛋白2(Non-structural protein 2，Nsp2)的研究近況進(jìn)行綜述。

1 Nsp2概述

PRRSV 為單股正鏈RNA 病毒，屬尼多病毒目動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)[1]。其基因組全長約15.4 nt，包含10 個ORFs，分別為ORF1a、1b、2a、2b 以及3～5、5a、6～7。其中ORF1 位于基因組5' 端，包括ORF1a、1b，總長約12 kb，約占整個基因組的3/4，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白-病毒聚合酶，兼具病毒復(fù)制酶活性。位于ORF1a 終止密碼子UAG 上游的7 堿基結(jié)構(gòu)(UUUAAAC)和可能形成RNA 擬節(jié)的序列，是聚合酶翻譯過程中核糖體移碼所必須的2 種結(jié)構(gòu)[2]。ORF1a 在病毒復(fù)制中，先被翻譯成ppla 多聚蛋白，ORF1b 通過核糖體轉(zhuǎn)移碼轉(zhuǎn)移成pplab 多聚蛋白。之后分別被水解為Nsp1～8和Nsp9～12，其中，Nsp2 是PRRSV 最大的復(fù)制蛋白。PRRSV 感染早期Nsp1β、Nsp2、Nsp4、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8 定位于細(xì)胞核周，原位標(biāo)記顯示它們共定位的位置為病毒RNA 復(fù)制場所[3]。

Nsp2 基因長度約為2.9 kb，不同病毒株因序列存在變異而長度不一。Nsp2 的保守性最差，在美洲株和歐洲株中氨基酸序列同源性僅為32 %。其抗原表位多，而表位集中的區(qū)域容易發(fā)生基因缺失或突變。

Nsp2 包含3 個結(jié)構(gòu)域，分別是靠近N 末端的半胱氨酸酶(PL2)區(qū)域、中間的高變區(qū)(HV)和靠近C 末端的跨膜區(qū)(TM)。在PRRSV 感染病毒期間，Nsp2 被PL2 水解為nsp2a、nsp2b、nsp2c、nsp2d、nsp2e 和nsp2f，這些nsp2使用相同的N 末端和不同的C 末端。Nsp2 是一個與病毒相關(guān)的PRRSV 蛋白，PRRSV 在復(fù)制過程中出現(xiàn)不同大小的Nsp2 亞類，他們共享PL2 區(qū)域的227 個氨基酸的N端。產(chǎn)生的這些不同分子量的Nsp2 可能存在不同的功能，大分子的Nsp2 出現(xiàn)在感染早期，可能對病毒的早期復(fù)制起關(guān)鍵作用[4-5]。Nsp2 以多亞型存在于病毒包膜上，在病毒包裝時與病毒包膜融合有關(guān)；還存在于細(xì)胞突起上，與細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系密切相關(guān)，其所誘導(dǎo)的體液免疫所產(chǎn)生的抗體與結(jié)構(gòu)蛋白N 蛋白形成的免疫水平相當(dāng)。其N 末端具有保守的催化N 末端半胱氨酸和組氨酸殘基的活性，并被認(rèn)為具有半胱氨酸蛋白酶的活性[6]。此外，Nsp2 還是Nsp4 絲氨酸蛋白酶的輔助因子，與細(xì)胞和組織嗜性有關(guān)[7]，在病毒復(fù)制過程中，參與多聚蛋白的裝配[8]。重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，4 h 即可檢測到Nsp2 的表達(dá)，并且主要定位于細(xì)胞核周圍，隨著感染時間延長，Nsp2 分布范圍逐漸擴(kuò)大至整個細(xì)胞質(zhì)。

2 Nsp2的高變性

Nsp2 在非結(jié)構(gòu)蛋白中變異性最大，包括缺失和插入，其遺傳多樣性在PRRSV 間比較普遍，并且其多數(shù)突變?yōu)榉侵滤佬酝蛔儭Ｈ鏧H-GD 株的Nsp2 編碼區(qū)320 位到424位對于XH-GD 株的復(fù)制是非必需的[9]。對中國的PRRSV進(jìn)行調(diào)查分析，Nsp2 基因具有廣泛的變異性[10]。在我國分離的39 個病毒株中，通過Nsp2 比對可將它們分為C、G、H 和Z 4 個型，病毒同型之間仍有很大差異[11]。國內(nèi)自2006 年暴發(fā)HP-PRRS，其HP-PRRSV 的變異主要以非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2 連續(xù)缺失30 個氨基酸為特征，并且強(qiáng)毒株在易感細(xì)胞系中傳代導(dǎo)致病毒毒力變?nèi)跬瑫r伴有Nsp2 缺失的報導(dǎo)屢見不鮮，如TJ 株在Marc-145 中傳代后的致弱的TJM 株，連續(xù)缺失120 個氨基酸；JX143 在Marc-145中傳代100 代后得到的弱毒株JXM100 株，Nsp2 缺失88個氨基酸，美洲型病毒NC16845b 在細(xì)胞系中的復(fù)制速度較傳統(tǒng)病毒株慢，它缺失了8 個氨基酸。除了傳代導(dǎo)致基因組缺失，Gao 等首次報導(dǎo)了PRRSV Nsp2 天然缺失的病毒株HB-2(sh)/2002，在aa471～aa482 區(qū)間連續(xù)缺失12 個氨基酸[12]。另外還發(fā)現(xiàn)，在FJLYDX04 株的aa599～aa603序列中有5 個堿基的插入，這是中國第一株報導(dǎo)Nsp2 存在插入的病毒株[13]。此外，病毒株HZ-31 的Nsp2 區(qū)含有59 個不連續(xù)缺失，分別為aa467～aa474、aa498～aa519 和aa533～aa361，但它的481 位未像其他HP-PRRSV 株一樣缺失，在遺傳系統(tǒng)中分析，它是獨(dú)立于JXA1 和EM2007的一個單獨(dú)分支[14]。

Nsp2 的遺傳多態(tài)性與變異性一直收到關(guān)注，并且發(fā)現(xiàn)能夠引起基因突變的因素有很多。在宿主IFN-β 的免疫壓力下，PRRSV 的分子變異幾率增加，包括ORF5、Nsp2和Nsp3。PPRSV 與豬圓環(huán)病毒(PCV2a 或PCV2b)的共感染能夠誘導(dǎo)PRRSV 的突變，如ORF5、ORF6、ORF7 和Nsp2 序列在單獨(dú)感染PRRSV 時突變30 個氨基酸，PRRSV 和PCV2a 共感染時突變63 個氨基酸，PRRSV 和PCV2b 共感染時突變77 個氨基酸[15]。但這究竟與病毒毒力是否有關(guān)系，還不清楚。曾認(rèn)為HP-PRRSV 毒力的增強(qiáng)可能與Nsp2 缺失30 個氨基酸有關(guān)，但現(xiàn)已被試驗(yàn)證明與毒力無關(guān)[16]，但Nsp2 缺失與病毒毒力的增強(qiáng)或減弱卻始終同時發(fā)生，因此Nsp2 的變異與毒力的關(guān)系，還需要進(jìn)一步研究探索。

3 Nsp2與免疫學(xué)的相關(guān)性

Nsp2 蛋白是病毒蛋白中最大的蛋白，它參與多肽的組合和病毒的復(fù)制等復(fù)雜的過程，并富含抗原表位[17]。在Marc-145 細(xì)胞中傳代100 次的JX143 出現(xiàn)了Nsp2 不連續(xù)缺失88 個氨基酸和基因組序列隨機(jī)突變的情況。JXM100具有更好的細(xì)胞適應(yīng)性和病毒致弱性，在實(shí)驗(yàn)豬上同時注射JXM100 及其Nsp2 上缺失的88 個氨基酸能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的N 蛋白抗體，卻不能產(chǎn)生抵抗缺失的88 個氨基酸的抗體，表明這88 個氨基酸的缺失可以作為遺傳標(biāo)記來區(qū)別JXM100 和JX143[18]。

近年來，關(guān)于PRRSV 對豬免疫抑制的報導(dǎo)主要集中在對各種細(xì)胞因子的抑制及促進(jìn)方面，以間接反映宿主免疫反應(yīng)情況。Beura 等發(fā)現(xiàn)，PRRSV 的4 個非結(jié)構(gòu)蛋白對IFN-β 啟動子(IRF3)活性能夠起到有效的抑制作用。依據(jù)它們的影響大小，排序?yàn)镹sp1、Nsp2、Nsp11 和Nsp4[19]。Li 等證明，Nsp2 通過抵抗IFN 調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)的活性進(jìn)而強(qiáng)烈地抑制由仙臺病毒誘導(dǎo)的IFN-β 產(chǎn)生[20]。完整的Nsp2 和Nsp2 的半胱氨酸酶活性區(qū)域(PL2)均可以抑制仙臺病毒誘導(dǎo)的IRF-3 的磷酸化作用和核轉(zhuǎn)運(yùn)。在抵抗IRF-3 活性過程中，Nsp2 的PL2 是必須存在的。這表明Nsp2 在依賴IRF-3 的先天抗病毒防御中，起到重要的破壞作用。溫貴蘭的研究顯示，Nsp2 蛋白在PRRSV 感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)分布，并與RIG-I 信號通路中的一個銜接分子MAVS 和能夠激活細(xì)胞內(nèi)I 型IFN 信號通路的信號分子LSml4A 共定位，但不影響IRF3 或NF-κB 入核，表明PRRSV 對先天免疫的影響可能在細(xì)胞核內(nèi)[4]。Sun 等證明，Nsp2 的卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)區(qū)域能夠通過干擾NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而抑制IFN-I 的產(chǎn)生。Nsp2 OTU區(qū)域具有泛素連接酶活性，這個區(qū)域可以通過對IκBα 聚泛素化而抑制IκBα 的降解，而IκBα 是NF-κB 的抑制因子，因此它的穩(wěn)定存在，將抑制NF-κB 的活性[21]。而Fang 等證明，PRRSV WUH3 株Nsp2 蛋白的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)IκB 降解，激活NF-κB。并且確定了Nsp2 的高變區(qū)(aa179～aa782)對于激活NF-κB 是不可缺少的，并且它所刺激的活性與Nsp2 全長基本一致[22]。Chen 等將6 個已經(jīng)確定的Nsp2 B 細(xì)胞表位(ES2～ES7)在Ⅰ型PPRSV cDNA感染性克隆中分別刪除。其中，缺失ES3(pp1a aa691～aa722)、ES4(pp1a aa736～aa790)和ES7(pp1a aa1 015～aa1040)的感染性克隆能夠拯救出活病毒。在Marc-145 中，缺失ES3 的感染性克隆表現(xiàn)出溶細(xì)胞活性的增強(qiáng)和更高的病毒生長特性，缺失ES4 和ES7 變現(xiàn)出了溶細(xì)胞活性下降和略低的病毒生長活性。宿主體內(nèi)試驗(yàn)表明，缺失ES3 產(chǎn)生了高病毒量，缺失ES4 和ES7 表現(xiàn)出了病毒弱化。缺失ES3 的感染性克隆刺激細(xì)胞產(chǎn)生了一種獨(dú)特的mRNA 表達(dá)機(jī)制：能夠產(chǎn)生IL-1β 和TNF-α 的mRNA，這表明，與野毒相比，ES3 抗原可能改變IL-1β 和TNF-α 的應(yīng)答。進(jìn)一步研究表明，這兩種細(xì)胞因子無論在細(xì)胞中還是在PAM 中，均下調(diào)表達(dá)[23]。非結(jié)構(gòu)蛋白還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ 和IL-10。Burgara-Estrella 等通過動物實(shí)驗(yàn)確定PRRSV Nsp2 的非保守多肽(589SLYKLLLEV597)可以引起實(shí)驗(yàn)豬的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生IFN-γ[24]。

4 Nsp2基因非必需區(qū)及重組病毒疫苗的研究

Nsp2 在病毒復(fù)制中起到十分重要的作用，但其每個區(qū)域?qū)Σ《镜挠绊懘笮∮质遣灰粯拥?，在Nsp2 基因區(qū)存在必需區(qū)和非必需區(qū)，即Nsp2 的PL2 核心區(qū)域和直接下游區(qū)域?yàn)椴《緩?fù)制的必需區(qū)，其它區(qū)域則為非必需區(qū)，可以作為外源基因的插入部位。如在HP-PRRSV 致弱病毒株HuN4-F112 的Nsp2 基因區(qū)存在兩個病毒復(fù)制非必需區(qū)，插入豬瘟病毒的E2 中和表位編碼區(qū)進(jìn)行共表達(dá)[25]。呂健等通過互換強(qiáng)弱毒Nsp2 區(qū)域，構(gòu)建PRRSV 嵌合感染性克隆，獲得與野毒具有相似生長特性的Nsp2 替換的全長感染性克隆[26]。這些均表明Nsp2 的可改造性，將為Nsp2和PRRSV 的深入研究奠定基礎(chǔ)。

為控制及預(yù)防PRRS 的蔓延，各國均生產(chǎn)出了PRRSV疫苗用于控制病情，主要為滅活疫苗和的弱毒活疫苗，我國自主研發(fā)的CH-1R 株、R98 株、JXA1-R 株、HuN4-F112 株和TJM-F92 株等PRRS 活疫苗紛紛面市。由于Nsp2 是基因組中的高變區(qū)，因此很多疫苗株的遺傳標(biāo)記均位于Nsp2 上。

雖然弱毒活疫苗能夠?yàn)樨i群提供一定保護(hù)，但由于PRRSV 表現(xiàn)的抗體依賴增強(qiáng)效應(yīng)、免疫抑制及基因組的廣泛變異性等生物學(xué)特征，國內(nèi)外在新型疫苗如亞單位疫苗、基因疫苗和含有PRRS 免疫原型基因的重組疫苗加大了研究的力度。Kim 等通過在Nsp2 非關(guān)鍵區(qū)進(jìn)行缺失并插入肽標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)拯救病毒株毒力顯著降低，并能被特異抗原包被的ELISA 試劑盒檢測，再次驗(yàn)證了Nsp2 是用來發(fā)展標(biāo)記疫苗和弱毒苗的潛在靶基因[27]。單悅等對豬瘟免疫豬接種Nsp2△1882-2241 弱毒疫苗檢測發(fā)現(xiàn)，豬外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12 水平顯著上調(diào)，IL-10 水平顯著下調(diào)，而這都是基因缺失疫苗發(fā)揮效力的潛在機(jī)制[28]。梅林等通過對接種PRRSV Nsp2△1882-2241 株疫苗及感染HP-PRRSV 豬的血清中重要細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)IL-12p40、IL-2、TNF-α 等表達(dá)水平有了明顯的變化，表明機(jī)體的細(xì)胞免疫水平得到了提升[29]。Xu 等在對疫苗毒HuN4-F112 Nsp2 復(fù)制非關(guān)鍵區(qū)缺失25 個氨基酸，并插入新城疫N 蛋白免疫顯性B 細(xì)胞表位(49 個氨基酸)作為一種基因標(biāo)記疫苗，在動物體內(nèi)能同時產(chǎn)生對抗NDV NP及PRRSV 的特異性抗體，而且缺乏針對缺失的25 個氨基酸的抗體，免疫豬獲得很好的免疫保護(hù)，該疫苗可以作為一種有效的對抗PRRSV 的基因標(biāo)記苗[30]。

5 小 結(jié)

目前，PRRS 仍然是養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，了解PRRSV 的免疫機(jī)制并研制更有效并且安全的疫苗也仍然是目前的主要研究方向。Nsp2 被認(rèn)為是遺傳多樣性最高的非結(jié)構(gòu)蛋白，并且在病毒基因組中，被認(rèn)為是檢測PRRSV 進(jìn)化和分子流行病學(xué)調(diào)查的靶基因。到目前為止，亞洲地區(qū)中流行的HP-PRRSV 仍以不連續(xù)缺失30 個氨基酸的病毒株為主。Nsp2 的高變性和已經(jīng)顯現(xiàn)出對病毒的影響，并一直受到關(guān)注。

根據(jù)現(xiàn)有的研究成果，可以確定Nsp2 對于動物受病毒刺激后產(chǎn)生免疫反應(yīng)有很大的影響，在半胱氨酸酶活性區(qū)域(PL2)存在的情況下，可以抑制病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β；卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)區(qū)域能干擾NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制IFN-I 的產(chǎn)生；Nsp2 的高變區(qū)對于激活NF-κB 是不可缺少的，而且它所刺激產(chǎn)生的活性與Nsp2 全長基本一致。Nsp2 中的非必需區(qū)，可以作為外源基因的插入?yún)^(qū)域，為進(jìn)一步研究Nsp2 的功能及基因組修飾改造以更深入的研究和研制疫苗具有重要意義。Nsp2 的廣泛變異性，使其成為弱毒疫苗的主要遺傳標(biāo)記，不僅可以區(qū)分疫苗毒與野毒，還為生物安全評價提供參照。

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