朱士茂，李 慧，王春華，丁玉江，黃偉榮，郭采平

(深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，廣東 深圳 518107)

狂犬病(Rabies)為一種古老的侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)、可引起嚴(yán)重腦脊髓炎的烈性人畜傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎為100 %[1]。幾乎所有溫血動物均可以感染狂犬病病毒(Rabies virus，RV)，其中包括人等多種哺乳動物。目前尚無有效的狂犬病治療方法，暴露后及時接種狂犬病疫苗是最主要的預(yù)防手段。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估計，每年全世界因狂犬病造成的死亡人數(shù)約55 000 人，其中絕大多數(shù)發(fā)生在亞洲，因犬咬傷導(dǎo)致的人狂犬病病例數(shù)約占95 %[1]。我國是狂犬病高發(fā)國家，每年的狂犬病病例數(shù)僅次于印度，居世界第二位[2]?？袢∮煽袢〔《緦俨《疽?，其中作為代表種的RV 是引起狂犬病的主要病因[3]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和研究手段的進(jìn)步，人們對于RV 的結(jié)構(gòu)、基因功能等有了深入的認(rèn)識，為狂犬病疫苗的研制和改造積累了豐富的資料和理論依據(jù)。本文結(jié)合RV 最新的研究進(jìn)展，對RV 及宿主細(xì)胞對病毒感染應(yīng)答等方面作一綜述。

1 RV的形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)

RV 屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus)的代表種。RV 屬于負(fù)鏈RNA 病毒，其基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，約為12 000 nt。病毒粒子呈子彈狀，一端呈平坦或略凹狀，另一端呈半圓形。病毒粒子直徑約為75 nm、長為100 nm～300 nm[3]。RV 基因組從3' 到5' 端依次編碼5 種結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別為核蛋白基因(Nucleoprotein，N)、磷蛋白基因(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白基因(Matrix protein，M)、糖蛋白基因(Glycoprotein，G)和依賴RNA 的RNA 聚合酶基因(Large protein，L)，分別被2、5、5 和423 個非編碼核苷酸序列隔開[3]。這5 種結(jié)構(gòu)蛋白基因在基因組中的排列方式在整個彈狀病毒科家族的病毒中都是保守的[4]。在RV 基因組的兩端，存在一個50 nt～100 nt 的3' 先導(dǎo)RNA 序列(Leader)和5' 尾部序列(Trailer)，其中含有基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制的調(diào)控信號[3-4]。

RV 粒子的核心是由基因組RNA、N、P 和L 蛋白組成的核糖核酸蛋白體(Ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合物。RNP 是負(fù)責(zé)病毒基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制的功能單位，呈子彈狀，為右手螺旋結(jié)構(gòu)，每螺旋大約為7.5 nm，大小為165 nm×60 nm，完全舒展時長4.2 nm～4.6 mm[5]。病毒粒子的外被是一層緊密而完整的脂蛋白雙層囊膜，厚度約為7.5 nm～10 nm，為病毒粒子出芽時從細(xì)胞質(zhì)膜處獲得。在病毒囊膜表面為G 蛋白三聚體組成的長為8.3 nm～10 nm 的突出結(jié)構(gòu)(Spike)，參與病毒與宿主之間的相互作用以及決定RV 的免疫原性和致病力[5]。病毒囊膜和RNP之間由M 蛋白連接，M 蛋白在調(diào)控病毒復(fù)制、病毒裝配和出芽過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。

2 狂犬病病毒屬的分型

最初，根據(jù)血清學(xué)的方法，可以將狂犬病病毒屬分為4 個血清型和幾個尚待定的病毒株。血清Ⅰ型是經(jīng)典的RV，為地理分布最廣、流行性最大的一類；血清Ⅱ型為Lagos 蝙蝠病毒，最早分離自尼日利亞的蝙蝠腦；血清Ⅲ型為Mokola 病毒，最早分離自尼日利亞的地鼠；血清IV型為Duvenhage 病毒，首次在南非病人中分離。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA 測序技術(shù)被越來越多地用于狂犬病病毒屬的分類。Bourhy 等根據(jù)N 蛋白基因N 端500 nt 核苷酸序列的保守性，可以將狂犬病病毒屬分為7 種基因型(Genotype)：基因型I～I(xiàn)V 與血清型I～I(xiàn)V 吻合?；蛐蚔 和VI 分別為歐洲蝙蝠狂犬病毒1(European bat lyssavirus 1)和歐洲蝙蝠狂犬病毒2(European bat lyssavirus 2)；而在澳大利亞果蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的澳大利亞蝙蝠狂犬病毒(Australia bat virus)被定為基因VII 型[7]。Badrane等根據(jù)G 蛋白膜外區(qū)氨基酸的同源性分析，進(jìn)一步將狂犬病病毒屬的7 種基因型病毒株分為兩個遺傳譜系(Phylogroup)，分別為Phylogroup I 和Phylogroup II[8]。Phylogroup I 包括基因型I、IV、V、VI 和VII；Phylogroup II 包括基因型II、III。序列分析表明，G 蛋白膜外區(qū)氨基酸同源性在同一遺傳譜系的病毒株中大于74 %而在不同遺傳譜系間的病毒株中小于64 %[8]。

近年來，隨著研究手段的進(jìn)步，不斷有新的病毒株被發(fā)現(xiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)的狂犬病病毒屬成員超過200 株[9]。利用最新的病毒檢測技術(shù)，如大規(guī)模平行測序技術(shù)(Massively parallel sequencing)等，Ma 等最近從昆蟲細(xì)胞系草地貪夜蛾Sf9 細(xì)胞中也分離得到一株新型的狂犬病病毒屬病毒株[10]。因此，不排除未來會有更多的狂犬病病毒屬病毒株被發(fā)現(xiàn)和鑒定。目前，狂犬病病毒屬被分為RV 和狂犬病相關(guān)病毒兩大類，共計12 種基因型病毒和2 株新分離但尚未明確分類的Ikoma 和Bokeloh 狂犬病毒[11]。狂犬病相關(guān)病毒包括Mokola 病毒、Lagos 蝙蝠病毒、Duvenhage 病毒、歐洲蝙蝠狂犬病毒1、歐洲蝙蝠狂犬病毒2、澳大利亞蝙蝠狂犬病毒、Irkut 病毒、Khujand 病毒、Aravan 病毒、西高加索蝙蝠病毒和Shimoni 蝙蝠病毒。最新的國際病毒分類委員會根據(jù)狂犬病病毒屬病毒株系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和抗原特性，將狂犬病病毒屬分為兩個Phylogroup，其中基因型I～VII 與Badrane 等提出的分類結(jié)果一致，新的分類方法將Irkut 病毒、Khujand 病毒和Aravan 病毒歸為Phylogroup I，Shimoni 蝙蝠病毒歸為Phylogroup II，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的西高加索蝙蝠病毒則未歸為任何一個Phylogroup[11]。與此相對應(yīng)，目前市場上銷售的主要針對RV G 蛋白的狂犬病疫苗和抗狂犬病免疫球蛋白，全部是基于經(jīng)典的RV 株而制備的[12]，因此理論上可以保護(hù)Phylogroup I 病毒的感染而對Lagos 蝙蝠病毒、Mokola 病毒和西高加索蝙蝠病毒的感染無保護(hù)作用[9]。

3 RV的生命周期

自然界中，RV 通常是由患有狂犬病的犬等動物咬傷時從其帶有病毒的唾液而進(jìn)入機(jī)體的傷口。當(dāng)人被動物咬傷后，病毒從咬傷部位侵入機(jī)體。通常情況下病毒在侵入部分不增殖或僅少量增殖，也不侵入血液，而是進(jìn)入傷口的周圍神經(jīng)組織內(nèi)，然后以逆軸突的方式傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而侵入腦和脊髓的神經(jīng)細(xì)胞，開始細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程[13]。

RV 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制是在細(xì)胞質(zhì)中完成的。病毒通過囊膜表面的G 蛋白與細(xì)胞膜表面的受體識別和結(jié)合后，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用，病毒進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)吞體中，在低pH條件下，G 蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，促使病毒囊膜與內(nèi)吞體膜的融合，從而釋放病毒RNP 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[3]。由于RV 基因組為負(fù)鏈RNA，不能直接被宿主蛋白翻譯系統(tǒng)識別，必須要先轉(zhuǎn)錄出mRNA。病毒以RNP 中負(fù)鏈RNA 作為模板，在L 和P 蛋白組成的病毒RNA 聚合酶的作用下，從基因組RNA 的3' 依次轉(zhuǎn)錄出正鏈先導(dǎo)RNA 和5 種含有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的結(jié)構(gòu)蛋白基因mRNA，進(jìn)而翻譯出病毒結(jié)構(gòu)蛋白。5 種結(jié)構(gòu)蛋白中，除了G 蛋白是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上翻譯修飾外，其他4 種結(jié)構(gòu)蛋白均在游離核糖體上合成。當(dāng)mRNA 翻譯成蛋白時，病毒基因組復(fù)制開始。此時病毒RNA 聚合酶通讀(Read-through)所有轉(zhuǎn)錄信號，合成出一條全長的正鏈反義RNA，該RNA 也會被包裝成為RNP，作為合成負(fù)鏈基因組RNA 的功能性模板。最后，含有病毒基因組RNA 的RNP 與嵌合于質(zhì)膜處的病毒G 蛋白包裝出芽，釋放成熟的病毒粒子，進(jìn)而起始下一輪感染周期[5]。

4 RV基因的轉(zhuǎn)錄和基因組的復(fù)制

病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是高度協(xié)調(diào)的。當(dāng)病毒RNP 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，病毒基因的轉(zhuǎn)錄即被啟動，不需要任何新合成蛋白的參與。序列分析發(fā)現(xiàn)，在RV 5 種結(jié)構(gòu)蛋白基因的兩端存在保守的轉(zhuǎn)錄起始信號序列和轉(zhuǎn)錄終止信號序列，保守模序分別為3'-UUGU-5'和3'-A/UCUUUUUUUG-5'，并且上游基因的轉(zhuǎn)錄終止信號與下游基因的轉(zhuǎn)錄起始信號之間含有非轉(zhuǎn)錄的基因間隔序列(Intergenic region)，這些信號序列在病毒基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。

早期的研究認(rèn)為，RV 基因的轉(zhuǎn)錄起始于病毒基因組3' 端的第一個堿基[14]。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，Whelan 等證明RV 基因組中僅含有一個啟動子，位于基因組3'端的先導(dǎo)RNA 序列中[15]。RV 基因轉(zhuǎn)錄是由L 蛋白和作為輔助因子的P 蛋白組成的復(fù)合物執(zhí)行，依次轉(zhuǎn)錄下游基因[15]。除了病毒組分外，宿主蛋白翻譯過程中的延伸因子EF-1-αβγ 復(fù)合物、Hsp60 和鳥苷轉(zhuǎn)移酶也是病毒RNA 轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物的組分，表明宿主蛋白在病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]。由于結(jié)構(gòu)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄均從3'-UUGU-5'的第一個U 開始，因此5 種結(jié)構(gòu)蛋白基因mRNA 的5' 端均是相同的，推測可能是與病毒選擇性調(diào)控自身基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)；當(dāng)RNA 聚合酶遇到3'-A/UCUUUUUUUG-5' 轉(zhuǎn)錄終止信號時，RNA 聚合酶不再繼續(xù)轉(zhuǎn)錄下游基因，而是反復(fù)以U7 為模板，對mRNA 進(jìn)行多聚腺苷酸化(PolyA tail)[17]。RV 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控主要是通過基因與基因組3'端的啟動子之間的位置實現(xiàn)的。目前公認(rèn)RV 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控符合終止-起始模型(Stop-Start model)，即上游基因轉(zhuǎn)錄的終止對于下游基因的轉(zhuǎn)錄起始是必需的。當(dāng)病毒RNA 聚合酶完成上游基因轉(zhuǎn)錄后，在下游的基因間隔區(qū)有停留，然后才會起始下游基因的轉(zhuǎn)錄，在這期間大約有20 %～30 %的RNA 聚合酶從模板上脫落而不能參與下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此，RNA 聚合酶在每個基因的間隔區(qū)停留一次，則會損失20 %～30 %的RNA 聚合酶，從而造成病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平依次遞減約30 %[18]。這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式在整個單股負(fù)鏈RNA 病毒家族中都是保守的[4]。

當(dāng)病毒結(jié)構(gòu)蛋白翻譯出來時，病毒基因組復(fù)制開始啟動。RV 基因組3' 端先導(dǎo)RNA 和5' 端尾部序列的互補(bǔ)序列中均含有基因組復(fù)制的起始信號，可以分別起始基因組和反義基因組的復(fù)制[3]。RV 基因組復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄在以下3 個方面存在明顯的不同：1)與轉(zhuǎn)錄不需要新合成蛋白不同，病毒基因組的復(fù)制需要新合成的可溶性N 蛋白的參與；2)病毒基因組的復(fù)制起始于基因組3' 端的第一個核苷酸；3)與參與轉(zhuǎn)錄的RNA 聚合酶組分不同，參與病毒基因組復(fù)制的RNA 復(fù)制酶復(fù)合物由L、P 和N 蛋白組成，沒有宿主蛋白參與，N 和P 必須先形成復(fù)合物以保持N 蛋白處于可溶性狀態(tài)且特異性結(jié)合病毒RNA 序列[3]。一般認(rèn)為，當(dāng)病毒N 蛋白開始合成后不久，病毒基因組即起始復(fù)制。此時N 蛋白與轉(zhuǎn)錄出來的正鏈先導(dǎo)RNA 結(jié)合，一方面阻止先導(dǎo)RNA 在與N 基因的連接處終止轉(zhuǎn)錄，另一方面也可以阻止下游基因轉(zhuǎn)錄的起始，從而使RNA 持續(xù)合成，產(chǎn)生一條與基因組鏈互補(bǔ)的全長正鏈反義RNA。新合成的正鏈反義RNA 被N 蛋白包裹，可以作為功能性模板，大量合成基因組RNA。有研究表明，在RV 中，基因組兩端的復(fù)制起始信號強(qiáng)度是不同的，5' 端尾部序列的互補(bǔ)序列中的復(fù)制起始信號要遠(yuǎn)強(qiáng)于3' 端先導(dǎo)RNA 中的起始信號，造成基因組與反義基因組的不對稱性復(fù)制，產(chǎn)生的負(fù)鏈基因組RNA 約為正鏈反義基因組RNA 的50 倍，并直接造成出芽產(chǎn)生的子代病毒粒子中，含有負(fù)鏈基因組RNA 的病毒粒子數(shù)目是含有反義基因組RNA 數(shù)目的50 倍[19]。

5 宿主細(xì)胞對RV感染的應(yīng)答

5.1 病毒感染與宿主免疫應(yīng)答 與其他病毒一樣，RV侵入宿主細(xì)胞也會引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在進(jìn)化的過程中，病毒也相應(yīng)進(jìn)化出一些躲避或者抑制宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制，從而可以建立有效感染[20]。宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答包括先天性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)兩個方面。先天性免疫反應(yīng)是抵御病毒侵染的第一道防線，主要通過激活一些模式識別受體如TLR 等，產(chǎn)生類型I 干 擾素(Interferon，IFN)，包括IFNα 和IFNβ 等[20]。RV 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均可以誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)，包括通過視黃酸誘導(dǎo)基因I(Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)介導(dǎo)的類型I IFN 的激活[21]。研究發(fā)現(xiàn)，IFNβ 的表達(dá)可以極大降低RV 的致病性和病毒復(fù)制，表明IFNβ 參與宿主防御病毒感染[22]。RV 磷蛋白P 可以阻斷TANK 結(jié)合蛋白激酶1 磷酸化IFN 調(diào)節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)，從而抑制類型I IFN 應(yīng)答[23]。此外，P 蛋白也可以抑制類型I 和類型II IFN 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過與IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要下游底物STAT1 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而使STAT1 不能入核激活基因表達(dá)，阻斷IFN 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[24]，但P 蛋白不影響STAT1 的磷酸化，也不會造成其降解。此外，有研究表明，只有發(fā)生酪氨酸磷酸化的STAT1 和STAT2 才能被P蛋白結(jié)合，暗示只有當(dāng)IFN 信號通路被激活后，P 蛋白才與STAT1 和STAT2 結(jié)合[25]。

進(jìn)一步的研究表明，在RV 感染的細(xì)胞內(nèi)，會產(chǎn)生5種類型的P 蛋白，不僅有全長的P 蛋白P1，還可以通過內(nèi)部起始翻譯的方式產(chǎn)生另外4 種截短型的P 蛋白，分別為P2～P5[26]。研究發(fā)現(xiàn)，不同P 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位是通過入核信號序列和核輸出信號序列調(diào)節(jié)的[26]，序列分析表明，所有的P 蛋白均含有一個入核信號，位于蛋白的羧基末端，但P3～P5 缺少位于氨基末端的核輸出信號，該信號僅存在于P1 和P2 蛋白中，從而造成P1 和P2主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而P3～P5 主要定位在細(xì)胞核內(nèi)[26]。因此，P 蛋白不但可以通過阻斷STAT1 入核，而且可以在細(xì)胞核內(nèi)阻斷IFN 激活的生長因子3(IFN-stimulated growth factor 3，ISGF3)與IFN 激活應(yīng)答元件結(jié)合[26]。此外，核內(nèi)的P 蛋白也可以直接與STAT1 同源二聚體結(jié)合，阻斷其余γ 活化序列(γ-activated sequence，GAS)的結(jié)合[27]。同時，有研究表明P3 也可以促進(jìn)STAT1 與微管相互作用，從而抑制STAT1 的入核[28]。最后，有研究指出，P蛋白也會引起IFN 誘導(dǎo)的人早幼白血病(Promyelocytic leukaemia，PML)蛋白滯留在細(xì)胞質(zhì)中[29]。PML 是PML 核體組分，可能在細(xì)胞核蛋白分選、病毒防御和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[30]。盡管目前還不清楚PML 在RV 感染中的作用，但考慮到P 蛋白可以結(jié)合并保持PML 在細(xì)胞質(zhì)，推測PML 可能具有抗病毒的功能[30]。

5.2 細(xì)胞凋亡與病毒感染的關(guān)系 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡過程，在生物的生長發(fā)育以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要的作用[31]。許多嗜神經(jīng)性病毒通過造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而表現(xiàn)出神經(jīng)致病性。通常情況下，致病性的RV 一般不引起細(xì)胞凋亡，而經(jīng)過動物或者組織細(xì)胞傳代的病毒株較易引起細(xì)胞凋亡，但標(biāo)準(zhǔn)RV 株CVS 是個例外，盡管其具有致病性，但仍然能夠引起T 細(xì)胞凋亡[32]。研究發(fā)現(xiàn)，RV G 蛋白的水平和氨基酸序列在引起細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，高水平表達(dá)G 蛋白的病毒株如高度弱化的病毒株較容易引起細(xì)胞凋亡[33]。因此，病毒會保持其G 蛋白處于最適水平，以滿足其建立感染同時逃避宿主免疫反應(yīng)的需求。同時，RV 也可以通過其G 蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有的PDZ 結(jié)合位點募集細(xì)胞作用蛋白和沉默某些宿主細(xì)胞中的磷酸酶，抑制細(xì)胞凋亡，保持神經(jīng)細(xì)胞的活性，從而有利于病毒建立有效感染[34]。

6 小結(jié)和展望

狂犬病是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國公共健康的重大疾病，隨著貓、狗等寵物數(shù)量的增加，狂犬病的預(yù)防和控制在我國面臨著更加嚴(yán)峻的考驗。RV 具有復(fù)雜的復(fù)制周期，至今人們對其致病機(jī)理以及與宿主細(xì)胞的相互作用仍然不是非常清楚。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和研究手段的進(jìn)步，對于RV 結(jié)構(gòu)蛋白的功能、基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制、病毒與宿主相互作用以及直接操作病毒基因組等方面的研究均取得了重大進(jìn)展。這其中RV 反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立無疑具有里程碑式的意義，使得在分子水平上對RV 基因組進(jìn)行定向改造成為可能。利用這項技術(shù)，已成功構(gòu)建不同點突變和基因缺陷型突變株，為深入研究病毒基因功能和構(gòu)建更安全高效的狂犬病工程疫苗提供基礎(chǔ)。此外，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建的重組病毒作為疫苗載體或者外源蛋白表達(dá)載體已經(jīng)取得成功，具有廣闊的應(yīng)用前景。這些研究必將極大促進(jìn)RV 的分子生物學(xué)研究，對人類更有效地預(yù)防和控制狂犬病的發(fā)生具有重要的指導(dǎo)意義。

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