陳 寧，程 田，王 平，李俊鵬，張延忠，魯 藝，王曉煒

（1.深圳市藥品檢驗(yàn)所，深圳 518057；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.深圳市瑞鵬寵物醫(yī)院，深圳 518000）

寄生蟲烯醇化酶的研究進(jìn)展

陳 寧1，程 田2，王 平1，李俊鵬1，張延忠3，魯 藝1，王曉煒1

（1.深圳市藥品檢驗(yàn)所，深圳 518057；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.深圳市瑞鵬寵物醫(yī)院，深圳 518000）

烯醇化酶是糖酵解過(guò)程中促進(jìn)磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸相互轉(zhuǎn)換的重要催化酶，同時(shí)也是存在于真核和原核細(xì)胞表面的多功能酶。最近研究發(fā)現(xiàn)，它能夠激活纖溶酶原，參與病原的感染過(guò)程，而且也是主要的免疫刺激性蛋白和藥物作用靶點(diǎn)。本文綜述當(dāng)前寄生蟲烯醇化酶的研究成果，旨在探討其作為寄生蟲病的診斷、潛在候選疫苗及藥物靶點(diǎn)的可能性。

寄生蟲；烯醇化酶；糖酵解

烯醇化酶（enolase）又稱磷酸丙酮酸水合酶（phosphopyruvate hydratase），是一種廣泛存在于包括細(xì)菌和高等生物體內(nèi)的高度保守的酶［1］，在糖酵解的第九個(gè)步驟中，能促進(jìn)2-磷酸-D-甘油酸（2-PGA）與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的相互轉(zhuǎn)化［2］，磷酸烯醇丙酮酸將會(huì)經(jīng)由丙酮酸激酶的催化，使原本接在氧原子上的磷酸根轉(zhuǎn)移到ADP上，進(jìn)而生成ATP以及丙酮酸，這個(gè)反應(yīng)會(huì)放出大量的能量，因此，烯醇化酶在細(xì)胞能量代謝中起重要作用。

大多數(shù)生物體內(nèi)的烯醇化酶只有一種形式，但在哺乳動(dòng)物中它以3種不同形式的組織特異性同工酶存在，分別為α、β、γ型［3］。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的烯醇化酶通常以二聚體形式存在，而原核生物中則多以八聚體形式存在，如豬鏈球菌［4］。作為重要的細(xì)胞質(zhì)酶，它存在于很多真核和原核細(xì)胞表面，盡管它不具備經(jīng)典表面蛋白所擁有的信號(hào)肽、跨膜區(qū)等特點(diǎn)，但還是能夠在細(xì)胞表面表達(dá)［5］，而且能在豬蛔蟲的排泄/分泌物（ES）中檢測(cè)出來(lái)［6］。在真核細(xì)胞中，它存在于T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的表面。定位于不同位點(diǎn)的烯醇化酶發(fā)揮著不同的功能，除了催化糖酵解過(guò)程之外，烯醇化酶還參與了多種病原微生物對(duì)寄主的組織入侵和轉(zhuǎn)移過(guò)程，可以作為疫苗候選因子和藥物靶標(biāo)。近年來(lái)，寄生蟲烯醇化酶的研究多圍繞基因特性、蛋白特性、生物學(xué)分析、免疫原性等方面，本文就目前國(guó)內(nèi)外寄生蟲的烯醇化酶的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 原蟲烯醇化酶

1.1 瘧原蟲烯醇化酶 烯醇化酶存在于瘧原蟲生命周期的每一個(gè)階段。除了細(xì)胞質(zhì)之外，烯醇酶還與細(xì)胞核、食物泡、細(xì)胞骨架和等離子體膜形成有關(guān)。烯醇酶的多樣化定位表明，除了在糖酵解的催化作用之外，烯醇化酶可能參與許多其他生物功能。例如，惡性瘧原蟲裂殖子表面烯醇化酶可能參與紅細(xì)胞入侵，囊泡中的烯醇化酶可能參與食物泡形成，細(xì)胞核烯醇化酶可能在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用［7］。動(dòng)合子表面烯醇化酶主要具有兩個(gè)功能：結(jié)合到蚊蟲中腸上皮來(lái)對(duì)寄主進(jìn)行入侵；通過(guò)烯醇化酶內(nèi)部的賴氨酸肽段（DKSLVK）結(jié)合動(dòng)合子表面的纖溶酶原，激活寄主溶纖系統(tǒng)來(lái)侵染寄主［8］。Das研究小組2011年構(gòu)建了惡性瘧原蟲釀酒酵母的烯醇化酶缺失株Tetr-Eno2，該重組蛋白將Enolase1基因敲除，Enolase2基因的表達(dá)受四環(huán)素阻遏操縱子的調(diào)控。當(dāng)由于四環(huán)素阻遏操縱子的調(diào)節(jié)造成Enolase2低表達(dá)時(shí)，Tetr-Eno2缺失株生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)加入高濃度的強(qiáng)力霉素（10 μg/mL）時(shí)，Tetr-Eno2缺失株停止生長(zhǎng)，并且出現(xiàn)空泡碎片和蛋白表達(dá)水平的變化。當(dāng)恢復(fù)缺失株的惡性瘧原蟲烯醇化酶表達(dá)水平時(shí)，Tetr-Eno2缺失株恢復(fù)所有表型變化。這些研究說(shuō)明惡性瘧原蟲烯醇化酶對(duì)滋養(yǎng)體期的食物納蟲泡的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用［9］。在惡性瘧原蟲感染過(guò)程中，烯醇化酶可以延緩小鼠的瘧原蟲的入侵，并且降低小鼠的死亡率［10］。

1.2 弓形蟲烯醇化酶 剛地弓形蟲編碼兩個(gè)期特異性表達(dá)的烯醇化酶（ENO1、ENO2），二者核酸序列及氨基酸序列相似性很高，但是由于各自表達(dá)階段不同的代謝及適應(yīng)能力使得它們?cè)诿笇W(xué)動(dòng)力學(xué)上有一定的差異。Ruan等［11］發(fā)現(xiàn)弓形蟲烯醇化酶enolase 1 （TgENO1）存在于緩殖子階段，enolase 2（TgENO2）存在于速殖子階段，他獲得弓形蟲烯醇化酶的enolase 1的晶體結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行分析，其二級(jí)結(jié)構(gòu)為緩殖子期所特有，發(fā)現(xiàn)重組烯醇化酶（TgENO1）可以特異性結(jié)合TTTTCT片段，結(jié)果表明，弓形蟲烯醇化酶可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，enolase1可作為潛在藥物靶標(biāo)用于腦弓形蟲的治療。Holmes等［12］用RNA干涉的方法將烯醇化酶eno2 dsRNA導(dǎo)入弓形蟲，并成功將eno2基因沉默，在ENO1基因定位上呈現(xiàn)輕微表型變化。

張華景等［13］根據(jù)弓形蟲已知序列擴(kuò)增eno2基因，獲得eno2基因全長(zhǎng)1353bp，編碼444個(gè)氨基酸，分子量約為55 kDa。Western blot顯示，重組蛋白能被感染弓形蟲的犬陽(yáng)性血清識(shí)別，說(shuō)明ENO2具有較好的反應(yīng)原性，可以作為血清學(xué)診斷抗原。隨后將獲得的重組ENO2作為抗原，免疫BALB/c小鼠獲取高免血清后制備特異性強(qiáng)的單克隆抗體，成功篩選出2株特異性單抗。利用獲得的單克隆抗體，應(yīng)用FITC標(biāo)記的二抗進(jìn)行間接免疫熒光（indirect immunofluorescence，IFA）實(shí)驗(yàn)對(duì)ENO2進(jìn)行組織定位。熒光顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENO2在速殖子階段的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核都有分布，其中細(xì)胞核可見(jiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)。通過(guò)CFDA-SE標(biāo)記弓形蟲速殖子，流式細(xì)胞儀分析ENO2單抗對(duì)速殖子入侵Vero細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ENO2單抗抑制了速殖子的入侵，ENO2與弓形蟲入侵Vero細(xì)胞相關(guān)。

1.3 錐蟲與利氏曼原蟲烯醇化酶 在錐蟲和利氏曼原蟲體內(nèi)不同發(fā)育期蟲體內(nèi)烯醇化酶的表達(dá)水平可能不太相同。Paba等［14］通過(guò)指紋圖譜檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，克氏錐蟲體內(nèi)烯醇化酶在錐鞭毛體和無(wú)鞭毛體中的表達(dá)高于上鞭毛體。Rosenzweig等［15］發(fā)現(xiàn)墨西哥利士曼原蟲從前鞭毛體到無(wú)鞭毛體的分化過(guò)程中，糖酵解酶上調(diào)表達(dá)1.4倍，包括烯醇化酶在內(nèi)的胞漿糖酵解酶上調(diào)表達(dá)2倍。

Avilán等［16］認(rèn)為，盡管布氏錐蟲、克氏錐蟲和利士曼原蟲的烯醇化酶高度保守，并在機(jī)體代謝過(guò)程中扮演重要角色，但錐蟲和宿主烯醇化酶之間仍存在差異，在錐蟲烯醇化酶接近活性中心的位置有3個(gè)獨(dú)特的活性殘基，可以作為抗錐蟲藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。烯醇化酶存在于利士曼原蟲的表面分泌蛋白中，因此，可能是潛在的毒力因子作為纖溶酶原的受體參與蟲體入侵，它的定位和功能研究將為抗錐蟲藥物研發(fā)和疫苗研制提供新的切入點(diǎn)。

目前發(fā)現(xiàn)，烯醇化酶通過(guò)兩種途徑與血纖溶酶原結(jié)合：一種方式是烯醇化酶通過(guò)其氨基酸序列C端的兩個(gè)賴氨酸結(jié)合纖溶酶原；另一種方式使烯醇化酶以其肽鏈中部小段結(jié)構(gòu)域與纖溶酶原結(jié)合。Vanegas等［17］通過(guò)研究墨西哥利士曼原蟲烯醇化酶與纖溶酶原的相互作用，發(fā)現(xiàn)其序列中的一段肽段（AYDAERKMY）是這兩個(gè)蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。Swenerton等［18］研究發(fā)現(xiàn)，寡肽酶B（OPB）可以調(diào)節(jié)利士曼原蟲體內(nèi)烯醇化酶的表達(dá)，當(dāng)寄生蟲體內(nèi)的OPB基因被敲除時(shí)，烯醇化酶的表達(dá)明顯升高。另外，Albert等［19］發(fā)現(xiàn)，在血液中的布氏錐蟲的烯醇化酶可以作為RNA干涉（RNAi）的作用靶標(biāo)，由于RNAi干涉作用，在最初的24h，烯醇化酶的酶活力減少到16%，并且出現(xiàn)錐蟲發(fā)育延緩現(xiàn)象，2d后出現(xiàn)死亡。

1.4 球蟲和隱孢子蟲烯醇化酶 劉立恒［20］發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲烯醇化酶在未孢子化卵囊階段豐度小于孢子化卵囊階段，且在兩個(gè)時(shí)期均能恒定表達(dá)。他采用免疫蛋白組學(xué)方法，對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊可溶性蛋白的免疫原性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)烯醇化酶可被抗血清識(shí)別，具有免疫原性。

楊曉嬌［21］成功獲得微小隱孢子蟲的烯醇化酶序列，運(yùn)用親和層析分離純化目的蛋白，以純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔，制備抗重組蛋白的多克隆抗體，通過(guò)SDS-PAGE分析表明重組Enolase能被高效地表達(dá)。Western blot分析結(jié)果顯示純化的融合蛋白能被兔陽(yáng)性血清和His-Tag mouse mAb識(shí)別，表明融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)重組蛋白3次免疫后，兔血清多克隆抗體的效價(jià)達(dá)1:51200，與兔肌烯醇酶沒(méi)有交叉反應(yīng)性，提示該多克隆抗體具有很好的特異性。

1.5 泰勒蟲烯醇化酶 Cayir等［22］認(rèn)為烯醇化酶可作為治療泰勒蟲的大分子靶標(biāo)，他將環(huán)形泰勒蟲烯醇化酶的內(nèi)含子序列去掉后進(jìn)行克隆表達(dá)，獲得同源二聚體形式的烯醇化酶純化蛋白，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，所獲得的烯醇化酶的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)特征為今后研究設(shè)計(jì)針對(duì)抗泰勒蟲藥物奠定了基礎(chǔ)。

2 線蟲烯醇化酶

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶 Han等［23］獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲烯醇化酶（enolase）基因的1583bp全長(zhǎng)序列，含有最大開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），為1305 bp，5-非翻譯區(qū)（5'-UTR）長(zhǎng)62 bp，3-非翻譯區(qū)（3'-UTR）長(zhǎng)216 bp，SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，分子量約49 kDa。以自然感染的山羊血清作為一抗，Western blot結(jié)果顯示在49 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與推測(cè)ORF的蛋白大小近似。酶活性測(cè)定結(jié)果表明該重組蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性。

Kalyanasundaram等［24］比較捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)烯醇化酶重組蛋白（rHcENO）和ConA純化自身糖蛋白的免疫預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)二者均能刺激機(jī)體IgG水平升高，且ConA純化自身糖蛋白的免疫保護(hù)性比重組烯醇化酶（rHcENO）稍高。

2.2 豬蛔蟲烯醇化酶 Chen等［25］獲得了豬蛔蟲烯醇化酶的全長(zhǎng)序列，通過(guò)RNAi研究發(fā)現(xiàn)，豬蛔蟲幼蟲烯醇化酶由于RNAi的作用被沉默，并出現(xiàn)幼蟲生長(zhǎng)被抑制。通過(guò)構(gòu)建烯醇化酶pVAX-Enol真核表達(dá)質(zhì)粒，肌肉注射免疫昆明小鼠。研究結(jié)果顯示，pVAX-Enol cDNA疫苗免疫昆明小鼠可有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示疫苗具有一定的免疫保護(hù)作用，能夠有效地提高昆明小鼠抗豬蛔蟲感染能力［26］。

2.3 廣州管圓線蟲和旋毛蟲烯醇化酶 Zhang等［27］通過(guò)對(duì)烯醇化酶定位研究，發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲烯醇化酶大多存在于蟲體細(xì)胞質(zhì)中，如壁肌肉、生殖道、神經(jīng)環(huán)和消化道中等能量消耗比較大的部位，并不像預(yù)期的表皮和真皮層。這表明廣州管圓線蟲烯醇化酶可能參與其他的生物功能，而不是作為纖溶酶原的受體或者分泌性抗原組分。烯醇化酶也在細(xì)胞核中表達(dá)，表明它可能參與機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)。盡管廣州管圓線蟲曾寄生于宿主血管中，但由于烯醇化酶不存在于L3幼蟲和成蟲的表面，表明它可能有其他的入侵和免疫逃避機(jī)制。

Bien等［28］篩選肌肉旋毛蟲和成蟲旋毛蟲體內(nèi)可能存在的免疫反應(yīng)性蛋白，通過(guò)液相質(zhì)譜鑒定得到的18個(gè)蛋白中，有3個(gè)蛋白在成蟲和幼蟲體內(nèi)較為常見(jiàn)：烯醇化酶、熱休克蛋白及5'端核苷酸酶，它們?cè)谛x感染時(shí)可能扮演重要角色，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，因此對(duì)于旋毛蟲的早期診斷及疫苗研究有重要意義。

3 吸蟲烯醇化酶

Wang等［29］發(fā)現(xiàn)華枝睪吸蟲烯醇化酶（Csenolase）存在于華枝睪吸蟲的成蟲、后囊蚴、尾蚴和蟲卵四個(gè)生命階段中，在成蟲中高表達(dá)。免疫組化顯示，它存在于成蟲的皮膚和后囊蚴的囊壁上，當(dāng)抗華枝睪烯醇化酶血清抑制酶活性時(shí)，華枝睪烯醇化酶表現(xiàn)出活躍的酶活性催化反應(yīng)。體外培養(yǎng)試驗(yàn)顯示，Csenolase可能在寄生蟲的生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用，作為一種潛在的候選疫苗和藥物靶標(biāo)。Wang等［30］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)RNA干涉使華枝睪吸蟲烯醇化酶沉默表達(dá)，沉默效果對(duì)華枝睪吸蟲成蟲產(chǎn)生致死作用。Wang等［31］利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌構(gòu)建華枝睪吸蟲烯醇化酶（Csenolase）的基因工程疫苗，發(fā)現(xiàn)二者均能誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫，有一定程度的減蟲率和減卵率，烯醇化酶可作為候選口服疫苗而進(jìn)一步研究。

Manneck等［32］為尋找甲氟喹在血吸蟲體內(nèi)的結(jié)合蛋白，研究其藥物靶標(biāo)，分析甲氟喹通過(guò)抑制烯醇化酶而干擾糖酵解的過(guò)程，對(duì)血吸蟲童蟲在葡萄糖存在或不存在情況下，研究甲氟喹和3種已知糖酵解抑制劑（即氟化鈉、3-溴丙酮酸和甲萘醌）的代謝抑制作用。發(fā)現(xiàn)由于葡萄糖的存在，血吸蟲童蟲受甲氟喹、氟化鈉和3-溴丙酮酸影響較小，當(dāng)童蟲接觸到甲萘醌時(shí)葡萄糖失去保護(hù)作用。這些結(jié)果表明甲氟喹可以作為潛在的糖酵解抑制劑，烯醇化酶可能作為潛在的抗吸蟲藥物靶標(biāo)。

邱春輝等［33］對(duì)日本血吸蟲的烯醇化酶做了相關(guān)研究，指出該酶能在蟲體的表膜進(jìn)行表達(dá)，他們對(duì)血吸蟲烯醇化酶進(jìn)行表達(dá)，并將重組蛋白免疫小鼠，獲得24.28%的肝組織減卵率和21.45%的糞便減卵率，具有部分免疫保護(hù)效果。

4 絳蟲烯醇化酶

Gan等［34］獲得細(xì)粒棘球絳蟲1449 bp的全長(zhǎng)序列，包含分別位于78 bp和69 bp的兩個(gè)內(nèi)含子序列，該基因編碼433個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其氨基酸序列中含有一段跨膜區(qū)（aa104～aa124）。

對(duì)絳蟲烯醇化酶的免疫學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)該酶含有大量線性B細(xì)胞表位和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）表位。在這些表位中有2個(gè)重要肽段，即aa49和aa228～aa236。這兩個(gè)肽段均同時(shí)含有B細(xì)胞和CTL表位，分別位于跨膜區(qū)的兩側(cè)，能刺激體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。無(wú)論這種蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如何變化，它均可介導(dǎo)絳蟲對(duì)宿主的免疫刺激作用。說(shuō)明烯醇化酶具有較好的免疫診斷和疫苗應(yīng)用前景。

趙國(guó)雄等［35］利用在線分析工具設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增得到細(xì)粒棘球蚴序列，通過(guò)Swiss-Model建模分析烯醇化酶的3D結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能是一個(gè)位于蟲體表層表膜具有較好免疫診斷和疫苗應(yīng)用前景的膜蛋白，同時(shí)還能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因表達(dá)。王瑩等［36］從細(xì)粒棘球絳蟲cDNA中擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行表達(dá)，利用細(xì)粒棘球蚴病及其他幾種寄生蟲病患者的血清和健康人血清，通過(guò)ELISA法評(píng)價(jià)重組EgEno抗原的免疫診斷效果。重組EgEno可被細(xì)粒棘球蚴病患者血清識(shí)別，表明重組EgEno對(duì)細(xì)粒棘球蚴病有較好的免疫診斷價(jià)值。

王利曉等［37］采用Real time PCR技術(shù)，對(duì)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲在蟲體的不同發(fā)育階段烯醇化酶基因表達(dá)的差異進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)量與蟲體生命活動(dòng)的旺盛程度明顯呈正相關(guān)，該酶在頭節(jié)、孕節(jié)、幼節(jié)和成節(jié)不同發(fā)育階段上表達(dá)水平有顯著差異，并推測(cè)該烯醇化酶基因在蟲體寄生過(guò)程中對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝與能量的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。夏黨榮等［38］對(duì)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲烯醇化酶進(jìn)行原核表達(dá)分析，Westernblot結(jié)果表明，天然蛋白能夠被重組表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠的血清識(shí)別，出現(xiàn)兩條免疫印記條帶，天然蛋白能夠被重組表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠的血清識(shí)別，出現(xiàn)兩條免疫印記條帶，即天然蛋白以兩種形式（約47 kDa和40 kDa）存在，并具有抗原性，為該蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

黃艷等［39］應(yīng)用生物信息方法從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫(kù)中篩選出了亞洲帶絳蟲烯醇酶cDNA全長(zhǎng)序列，并預(yù)測(cè)得到其結(jié)構(gòu)與功能方面信息。杜武英等［40］對(duì)亞洲牛帶絳蟲成蟲烯醇化酶基因進(jìn)行原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，并定位在蟲卵的卵殼和胚膜上。戴佳琳等［41］和劉玉江等［42］分別對(duì)牛帶絳蟲和豬帶絳蟲烯醇化酶基因結(jié)構(gòu)和編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，對(duì)其蛋白特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維空間構(gòu)像等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。尤亞南等［43］獲得豬帶絳蟲的烯醇化酶全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可被豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清識(shí)別，并發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有纖溶酶原結(jié)合特性及酶活力，推測(cè)豬帶絳蟲烯醇化酶可能在寄生蟲入侵宿主過(guò)程中發(fā)揮作用，有作為藥物靶標(biāo)或疫苗候選分子的潛力。

綜上所述，烯醇化酶是大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲糖酵解中的關(guān)鍵酶之一，與寄生蟲的生存密切相關(guān)。烯醇化酶作為纖維蛋白溶酶原受體蛋白，被認(rèn)為是寄生蟲重要的致病因子之一，同時(shí)它具有較好的免疫原性，并可能作為候選疫苗或治療藥物靶標(biāo)。對(duì)該酶的深入研究，將有助于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其在寄生蟲的感染與免疫調(diào)節(jié)、能量代謝中的作用，為發(fā)展?jié)撛诘囊呙绾蜻x分子和有效的治療診斷方法奠定基礎(chǔ)。

［1］Rodriguez E， Romarís F， Lorenzo S， et al. A recombinant enolase from Anisakis simplex is differentially recognized in natural human and mouse experimenta linfections［J］. Med Microbiol Immunol， 2006， 195（1）: 1-10.

［2］Peshavaria M， Day I N. Molecular structure of the human muscle-specific enolase gene （ENO3） ［J］. Biochem J， 1991，275 （Pt 2）: 427-433.

［3］Segil N， Shrutkowski A， Dworkin M B， et al. Enolase isoenzymes in adult and developing Xenopus laevis and characterization of a cloned enolase sequence［J］. Biochem J， 1988， 251（1）: 31-39.

［4］Lu Q， Lu H， Qi J， et al. An octamer of enolase from Streptococcus suis［J］. Protein Cell， 2012， 3（10）: 769-780.

［5］Agarwal S， Kulshreshtha P， Bambah Mukku D， et al. alpha-Enolase binds to human plasminogen on the surface of Bacillus anthracis［J］. Biochim Biophys Acta，2008， 1784（7-8）: 986-994.

［6］Andrade M A， Siles-Lucas M， López-Abán J， et al. Antigens from Ascaris suum trigger in vitro macrophage NO production［J］. Parasite Immunol， 2005， 27（6）: 235-242.

［7］Bhowmick I P， Kumar N， Sharma S， et al. Plasmodium falciparum enolase: stage-specific expression and sub-cellular localization［J］. Malar J， 2009， 8:179.

［8］Ghosh A K， Marcelo J L. Surface-expressed enolases of Plasmodium and other pathogens［J］. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2011， 106 Suppl 1: 85-90.

［9］Das S， Shevade S， LaCount D J， et al. Plasmodium falciparum enolase complements yeast enolase functions and associates with the parasite food vacuole［J］. Mol Biochem Parasitol， 2011，179（1）: 8-17.

［10］Pal-Bhowmick I， Mehta M， Coppens I， et al. Protective properties and surface localization of Plasmodium falciparum enolase［J］. Infect Immun， 2007，75（11）: 5500-5508.

［11］Ruan J， Mouveaux T， Light S H， et al. The structure of bradyzoite-specific enolase from Toxoplasma gondii reveals insights into its dual cytoplasmic and nuclear functions［J］. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2015，71（Pt 3）: 417-426.

［12］Holmes M， Liwak U， Pricop I， et al. Silencing of tachyzoite enolase 2 alters nuclear targeting of bradyzoite enolase 1 in Toxoplasma gondii［J］. Microbes Infect， 2010， 12（1）: 19-27.

［13］張花景.弓形蟲ENO2基因的克隆表達(dá)、單克隆抗體制備及功能分析［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2014.

［14］Paba J， Santana J M， Teixeira A R， et al. Proteomic analysis of the human pathogen Trypanosoma cruzi［J］. Proteomics，2004， 4（4）: 1052-1059.

［15］Rosenzweig D， Smith D， Opperdoes F， et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage［J］. FASEB J， 2008， 22（2）: 590-602.

［16］Avilán L， Gualdrón-López M， Qui?ones W， et al. Enolase: a key player in the metabolism and a probable virulencefactor of trypanosomatid parasites-perspectives for its use as a therapeutic target［J］. Enzyme Res， 2011， 2011: 932549.

［17］Vanegas G， Qui~nones W， Carrasco-L′opez C， et al，Enolase as a plasminogen binding protein in Leishmania mexicana［J］. Parasitol Res， 2007， 101（6）: 1511-1516.

［18］Swenerton R K， Zhang S， Sajid M， et al. The Oligopeptidase B of Leishmania Regulates Parasite Enolase and Immune Evasion［J］. J Biol Chem， 2011， 286（1）: 429-440.

［19］Albert M A， Haanstra J R， Hannaert V， et al. Experimental and in silico analyses of glycolytic flux control in bloodstream form Trypanosoma brucei ［J］. J Biol Chem，2005， 280（31）: 28306-28315.

［20］劉立恒.柔嫩艾美耳球蟲比較蛋白組及免疫蛋白組研究［D］.南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

［21］楊曉嬌.微小隱孢子蟲烯醇酶特性的初步研究及類鈣調(diào)蛋白基因的真核和原核表達(dá)［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

［22］Cayir E， Erdemir A， Ozkan E， et al. Cloning of intronremoved enolase gene and expression， purification， kinetic characterization of the enzyme from Theileria annulata［J］. Mol Biotechnol， 2014， 56（8）: 689-696.

［23］Han K， Xu L， Yan R， et al. Molecular cloning， expression and characterization of enolase from adult Haemonchus contortus［J］. Res Vet Sci， 2012，92（2）: 259-265.

［24］Kalyanasundaram A， Jawahar S， Ilangopathy M， et al. Comparative immunoprophylactic efficacy of Haemonchus contortus recombinant enolase （rHcENO） and Con A purified native glycoproteins in sheep ［J］. Exp Parasitol，2015， 23（154）: 98-107.

［25］Chen N， Xu M J， Nisbet A J， et al. Ascaris suum: RNAi mediated silencing of enolase gene expression in infective larvae［J］. Exp Parasitol， 2011，127（1）: 142-146.

［26］Chen N， Yuan Z G， Xu M J， et al. Ascaris suum Enolase is a potential vaccine candidate against Ascarisis in mice［J］. Vaccine， 2012， 30（23）: 3478-3482.

［27］Zhang J， Yu C， Wang Y， et al. Enolase of Angiostrongylus cantonensis: more likely a structural component？ ［J］. Parasitol Res， 2014，113（11）: 3927-3934.

［28］Bien J， Cabaj W， Moskwa B， et al. Proteomic analysis of potential immunoreactive proteins from muscle larvae and adult worms of Trichinella spiralis in experimentally infected pigs［J］. Folia Parasitol （Praha）， 2015，1: 62.

［29］Wang X， Chen W， Hu F， et al. Clonorchis sinensis enolase: identification and biochemical characterization of a glycolytic enzyme from excretory/secretory products［J］. Mol Biochem Parasitol， 2011， 177（2）: 135-142.

［30］Wang X， Chen W， Tian Y， et al. RNAi-mediated silencing of enolase confirms its biological importance in Clonorchis sinensis［J］. Parasitol Res， 2014， 113（4）: 1451-1458.

［31］Wang X， Chen W， Tian Y， et al. Surface display of Clonorchis sinensis enolase on Bacillus subtilis spores potentializes an oral vaccine candidate［J］. Vaccine， 2014，32（12）:1338-1345.

［32］Manneck T， Keiser J， Müller J. Mefloquine interferes with glycolysis in schistosomula of Schistosoma mansoni via inhibition of enolase ［J］. Parasitology， 2012，139（4）: 497-505.

［33］邱春輝.日本血吸蟲重組烯醇化酶研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)， 2009.

［34］Gan W， Zhao G， Xu H， et al. Reverse vaccinology approach identify an Echinococcus granulosus tegumental membrane protein enolase as vaccine candidate［J］. Parasitol Res， 2010，106（4）: 873-882.

［35］趙國(guó)雄，甘文佳，武偉華，等.細(xì)粒棘球絳蟲烯醇酶（EgEnolase）基因的克隆和序列分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009， 9（11）: 1221-1226.

［36］王瑩，張璟，袁忠英，等.細(xì)粒棘球絳蟲烯醇酶基因克隆表達(dá)及免疫診斷研究［J］.中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2012，24（5）: 549-554.

［37］王利曉，薄新文，張銀亮，等.擴(kuò)展莫尼茨絳蟲烯醇化酶基因的克隆及其組織表達(dá)差異分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010， 40（6）: 572-578.

［38］夏黨榮，陳南穎，馬勛，等.擴(kuò)展莫尼茨絳蟲烯醇化酶基因的原核表達(dá)及抗原性鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012， 34（3）: 241-143.

［39］黃艷，黃江，胡旭初，等.亞洲帶絳蟲烯醇酶基因及其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2008，29（5）: 575-580.

［40］杜武英，戴佳琳，黃江，等.亞洲帶絳蟲烯醇化酶基因的原核表達(dá)、鑒定與組織定位［J］.中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2009， 27（6）: 458-462.

［41］戴佳琳，黃江，廖興江.生物信息學(xué)分析牛帶絳蟲烯醇酶基因及其蛋白的結(jié)構(gòu)和特性［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2010，10（10）:1169-1172.

［42］劉玉江，王宇，黃江.豬帶絳蟲成蟲烯醇酶基因的生物信息學(xué)分析［J］.貴州醫(yī)藥， 2011， 35（5）: 387-391.

［43］尤亞南，李繼東，駱學(xué)農(nóng)，等.豬帶絳蟲烯醇化酶基因的原核表達(dá)及鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2014， 44（3）: 221-226.

RESEARCH PROGRESS ON ENOLASE OF PARASITES

CHEN Ning1， CHENG Tian2， WANG Ping1， LI Jun-peng1， ZHANG Yan-zhong，LU Yi1， WANG Xiao-wei1
（1. Shenzhen Institute for Drug Control， Shenzhen 518057， China； 2. College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University，Guangzhou 510642， China； 3. Shenzhen Ruipeng Pet Hospital，Shenzhen 518000， China）

Enolase， an important glycolytic enzyme that catalyses the conversion of phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate， was identified as a multifunctional protein on the surface of most eukaryotic and prokaryotic cells. Recent studies have revealed that this enzyme could activate the plasminogen，involving in the processes of parasite infection. It is also considered to be a major immunostimulatory protein and drug target. This paper reviews the current research results in parasite enolase， and explores its potential for diagnosis， vaccine candidate and drug targets of parasitic diseases.

Parasite； enolase； glycolytic

S 852.7

A

1674-6422（2015）04-0081-06

2015-05-07

深圳市科技研發(fā)資金知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20130402144215888）

陳寧，女，博士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病的防控

陳寧，E-mail:cn82cn@163.com