白 靚，成 巖，劉 燕，張樹軍，曹瑞珍

以乙型肝炎核心病毒蛋白為載體融合金黃色葡萄球菌IsdA表位多肽的免疫原性

白 靚1,2，成 巖3，劉 燕1,2，張樹軍1，曹瑞珍1

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，Saureus)，是一種最常見的條件致病菌?？梢砸鹑撕蛣?dòng)物的多種類疾病，感染牛導(dǎo)致的牛乳房炎給奶牛產(chǎn)業(yè)造成巨大損失；感染人可引起皮膚和軟組織感染，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺炎、菌血癥、膿毒血癥、心內(nèi)膜炎及骨髓炎[1]。Saureus中存在大量的耐藥株，尤其是耐甲氧西林Saureus，降低了抗生素療法的可靠性[2]。疫苗可以通過主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫途徑切斷感染輔助抗生素療法，但至今還沒有商品化的Saureus疫苗上市，研發(fā)競(jìng)賽已在全世界范圍展開[3]。

鐵調(diào)節(jié)表面決定因子A(iron-regulated surface determinant A，IsdA)是Saureus表面蛋白中的一員，由350aa組成，功能是參與細(xì)菌對(duì)血紅素中鐵的攝取。IsdA的N-末端為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域，與轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、血紅素、角質(zhì)細(xì)胞的包膜蛋白等受體結(jié)合，幫助S.aureus的粘附及傳播[4]。IsdA的C-末端結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)S.aureus親水性，能逃避人類皮膚分泌殺菌脂肪酸、抗菌肽的殺傷[5]。Stapleton等[6]報(bào)道IsdA215-310多肽高度保守，且使用這段表位多肽免疫小鼠后可誘導(dǎo)具有調(diào)理吞噬功能的保護(hù)性抗體，但產(chǎn)生抗體滴度較低。據(jù)此我們推斷IsdA215-310含有抗原表位，為了進(jìn)一步提高IsdA215-310的免疫原性，我們嘗試使用乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein，HBc)作為載體。HBc載體是將其(共183aa)N端144個(gè)aa裝配成的類病毒顆粒，外源的表位可以通過基因工程方法插入到HBc載體的N端、C端或免疫顯性區(qū)(MIR區(qū)，位于HBc76-82aa)，其中MIR區(qū)在提高外源表位免疫原性方面效果最佳[7]。Clarke等首次使用HBc作為表位載體并闡釋其優(yōu)點(diǎn)，他們選擇口蹄疫病毒的主要抗原VP1蛋白作為研究對(duì)象，將VP1的表位放至HBc的N末端，結(jié)果顯著提高了多肽的免疫原性[8]。

本研究我們用基因工程法將IsdA215-310多肽插入到HBc的MIR區(qū)，通過大腸桿菌表達(dá)制備出融合蛋白抗原，通過小鼠免疫試驗(yàn)評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)抗體的水平，及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用，為預(yù)防性S.aureus疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因、質(zhì)粒與菌株 HBc(GenBank,No:429475205)，IsdA (GenBank,No:ap009351.1)；表達(dá)載體pET28b(+)、表達(dá)菌株BL21(Novagen)；大腸桿菌DH5α、Saureus(Newman株)由內(nèi)蒙古民族大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 限制性核酸內(nèi)切酶(NcoⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ)(寶生物)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000、MarkerⅢ，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)14.4～94.0 kDa(天根生物公司)；WB預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)SM0671(Thermo)； HisTrap FF(GE Healthcare)； HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；rIsdA蛋白、rIsdA多克隆抗體(兔源，1∶12 800),內(nèi)蒙古民族大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備保存；弗氏佐劑(sigma)；BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 基因設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GenBank公布序列，設(shè)計(jì)目的基因HBc-IsdA215-310，結(jié)構(gòu)示意圖(圖1)。IsdA215-31095aa插入替換HBc(144aa)的第76～82位aa，共232aa，696 bp?；蛏嫌我隢coⅠ序列，下游引入XhoⅠ序列。序列由上海生工公司合成，質(zhì)粒命名pUC57-HBc-IsdA215-310。

1.4 pET28-HBc-IsdA215-310載體構(gòu)建與表達(dá) 對(duì)提取質(zhì)粒pUC57-HBc-IsdA215-310、pET28b(+)雙酶切(NcoⅠ，XhoⅠ)。使用凝膠回收試劑盒制備載體與目的基因，并對(duì)回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化，通過酶切、測(cè)序鑒定陽性克隆。提取陽性質(zhì)粒pET28-HBc-IsdA215-310轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)，篩選陽性克隆菌37 ℃培養(yǎng)，菌體OD600為0.5時(shí)用IPTG誘導(dǎo)，6～8 h后離心收集菌體，超聲破碎，離心收集沉淀與上清，12% SDS-PAGE。

1.5 Western blot及純化 HBc-IsdA215-310蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，一抗選擇兔源rIsdA多克隆抗體(稀釋度1∶1 000)孵育過夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗(稀釋度1∶1 000)，DAB顯色，水洗膜終止反應(yīng)，記錄結(jié)果。純化蛋白首先超聲破碎菌體，經(jīng)鑒定蛋白存在上清中，收集超聲裂解液上清用0.45 μm濾膜過濾后，過HisTrap FF鎳柱，洗脫緩沖液梯度洗脫，收集樣品12% SDS-PAGE。

1.6 小鼠分組及免疫 BALB/c小鼠分為4組，每組10只，分別為HBc-IsdA215-310、HBc-IsdA215-310添加佐劑、rIsdA添加佐劑，對(duì)照組(PBS)。免疫方法采用小鼠腿部肌肉注射，免疫接種共2次，分別于0 d、11 d，劑量100 μg/只。蛋白抗原去內(nèi)毒素后，第1次免疫接種使用等體積弗氏完全佐劑，第2次用弗式不完全佐劑。免疫動(dòng)物的采血時(shí)間為11 d、20 d，每次隨機(jī)選取5只小鼠尾靜脈取血，進(jìn)行IgG抗體效價(jià)檢測(cè)。

1.7 抗體ELISA檢測(cè)及小鼠攻毒試驗(yàn) 間接ELISA法檢測(cè)血清IgG，分別取rIsdA、HBc-IsdA215-310抗原(1 mg/mL)4 ℃過夜包被ELISA板，次日置于含有BSA的封閉液中封閉反應(yīng)1 h。取實(shí)驗(yàn)組鼠血清按1∶100倍稀釋的初始濃度加入到ELISA板內(nèi)，按倍比稀釋法稀釋，37 ℃孵育1 h，洗滌液沖洗5遍后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育反應(yīng)1 h，洗滌及TMB顯色，用酶標(biāo)儀在492 nm測(cè)定各孔吸光值，樣品OD值≥2.1陰性對(duì)照OD值，判定為陽性，并記錄最終效價(jià)值；攻毒試驗(yàn)：取30 μL凍存的菌液接種到TSB培養(yǎng)基上復(fù)壯，按平板計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)基細(xì)菌數(shù)。取初次免疫后21 d小鼠(10只)，腹腔內(nèi)接種2×1010CFU/只(LD50)[9]，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒載體酶切鑒定結(jié)果 pET28-HBc-IsdA215-310質(zhì)粒采用XhoⅠ與XbaⅠ雙酶切后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段約為730 bp和5 200 bp(圖2)，結(jié)果與預(yù)期一致。

2.2 重組蛋白表達(dá)、純化結(jié)果 HBc-IsdA215-310表達(dá)菌誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、純化及rIsdA對(duì)照的SDS-PAGE電泳，結(jié)果在26 kDa、38 kDa左右出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果與預(yù)期一致(圖3)。

M: DNA markerⅢ; 1: pET28-HBc-IsdA215-310; 2: Digested byXhoⅠandXbaⅠ.

圖2 pET28-HBc-IsdA215-310的酶切鑒定

Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids pET28-HBc-IsdA215-310

M: Protein molecular weight marker; 1: Unintruduced bacteria expressing HBc- IsdA215-310; 2: Intruduced bacteria expressing HBc-IsdA215-310; 3: Purified HBc- IsdA215-310; 4: Purified rIsdA.

圖3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

Fig.3 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 by SDS-PAGE

2.3 重組蛋白的Western blotting 分析 取rIsdA多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗，對(duì)重組蛋白HBc- IsdA215-310及 rIsdA進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示在26 kDa和38 kDa附近位置出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期一致(圖4)。

M: Protein molecular weight marker; 1: HBc- IsdA215-310; 2: rIsdA..

圖4 重組蛋白的western blot 分析

Fig.4 Analysis of the recombinant proteins HBc-IsdA215-310 and rIsdA by western blot

2.4 重組蛋白HBc- IsdA215-310在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性抗體的檢測(cè) 間接ELISA法檢測(cè)血清特異性IgG。使用rIsdA作為包被抗原在20 d檢測(cè)IgG效價(jià), rIsdA添加佐劑組與HBc-IsdA215-310添加佐劑組相比較(P=0.004,P<0.01)(表1)；使用HBc-IsdA215-310作為包被抗原在20 d檢測(cè)IgG效價(jià)，HBc-IsdA215-310添加佐劑組與rIsdA添加佐劑組相比較(P=0.002,P<0.01)(表2)。免疫組能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)高特異性IgG抗體。

表1 rIsdA作為包被抗原檢測(cè)免疫血清特異性抗體效價(jià)值

Note: *P<0.01 compared with HBc-IsdA215-310+adjuvant.

表2 HBc-IsdA215-310作為包被抗原檢測(cè)血清特異性抗體效價(jià)值

Note:*P<0.01 compared with rIsdA+adjuvant.

2.5 攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫組和對(duì)照組在初次免疫后21 d開始攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察7 d。結(jié)果顯示，HBc-IsdA215-310添加佐劑組保護(hù)率70%(P=0.370)，HBc-IsdA215-310保護(hù)率60%(P=0.656)，rIsdA保護(hù)率50% (P=1.000)，PBS對(duì)照組保護(hù)率40%。各免疫組與PBS對(duì)照組相比(P>0.05)，免疫組與對(duì)照組免疫保護(hù)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

Fig.5 Efficacy of immunization with antigens against LD50S.aureuschallengein mice

3 討 論

隨著Saureus的耐藥株比例不斷攀升及抗生素的濫用，給Saureus感染的治療帶來巨大困難。通過疫苗接種預(yù)防Saureus感染是一種理想的治療方案。根據(jù)Saureus構(gòu)建的滅活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、特異性單克隆抗體在臨床實(shí)驗(yàn)中均以失敗告終[10]，這一結(jié)果對(duì)疫苗抗原的選擇提出了更苛刻的要求。

為了設(shè)計(jì)新型Saureus疫苗，我們選擇應(yīng)用HBc為載體蛋白攜帶Saureus抗原表位，以此提高抗原的免疫原性。HBc本身具有Th表位，可以幫助產(chǎn)生針對(duì)外源表位的抗體；HBc與外源表位能共同組裝成直徑為36 nm大小的類病毒顆粒，有利于抗原的加工呈遞[11]；HBc還具有T細(xì)胞非依賴抗原的特征，可以直接激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并擁有強(qiáng)大的誘導(dǎo)針對(duì)外源表位的B、Th、CTL細(xì)胞應(yīng)答的能力[12]。HBc載體的插入位置選擇靈活，可以選擇N末端，C末端及MIR區(qū)(76-82aa)，通過對(duì)HBc空間結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MIR區(qū)在誘導(dǎo)抗HBc抗體方面占絕對(duì)主導(dǎo)，將該區(qū)域替換成外源表位，可誘導(dǎo)出抗該表位的特異性抗體[13]。本研究選擇使用MIR區(qū)作為插入位點(diǎn)，利用已知的基因序列信息，通過全基因合成法直接合成出嵌合蛋白的基因，減少了抗原從設(shè)計(jì)到制備的時(shí)間。除了對(duì)插入位點(diǎn)的選擇外，對(duì)于外源插入表位多肽片段的長(zhǎng)度也要加以限制，表位長(zhǎng)度最小可以是5～15aa的B細(xì)胞表位，片段最大載量為258aa的綠色熒光蛋白片段，超出這一范圍會(huì)影響HBc的空間結(jié)構(gòu)，降低免疫原性[14]。本研究使用95aa的IsdA215-310片段，對(duì)HBc的空間正確折疊影響有限。對(duì)于插入抗原的選擇，應(yīng)選擇分子量大小適中，免疫原性強(qiáng)，高度保守性的蛋白，而IsdA符合上述條件。Stranger等[9]及Schneewind等[15]利用IsdA的抗原特征進(jìn)行疫苗研究，取得理想的效果，而我們選取的IsdA215-310已被證實(shí)能誘導(dǎo)具有調(diào)理吞噬功能的抗體[6]。

本研究使用HBc作為載體與IsdA215-310在大腸桿菌中嵌合表達(dá)，通過Western blot分析及小鼠免疫試驗(yàn)分析所表達(dá)蛋白的免疫活性，結(jié)果表明嵌合基因能夠在大腸桿菌系統(tǒng)中正確表達(dá)，而且表達(dá)蛋白經(jīng)過分離純化可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性的IgG抗體(效價(jià)值：20480±7010)，對(duì)完成免疫程序后的小鼠使用Newman株LD50攻毒，免疫保護(hù)率達(dá)70%，雖然比rIsdA免疫保護(hù)率(50%)高出了20%，但經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)確定(P>0.05)兩者差異不顯著；各免疫組與PBS對(duì)照組相比(P>0.05)差異不顯著。HBc-IsdA215-310免疫組對(duì)小鼠免疫保護(hù)率最高，這可能與HBc特有的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)促進(jìn)外源抗原表位在體內(nèi)的加工與呈遞有關(guān)，而IsdA215-310中存在表位的種類與結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步的表位作圖來證實(shí)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果雖然沒有達(dá)到100%保護(hù)，但給我們提供了一個(gè)思路，下一步可以從Saureus表面蛋白中選取其抗原表位進(jìn)行與此相似的實(shí)驗(yàn)，制備出多亞單位聯(lián)合疫苗，提高免疫保護(hù)率。除此之外，本實(shí)驗(yàn)所涉及到的攻毒菌株種類(Newman株)，使用的疫苗佐劑類型(弗氏佐劑)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(BALB/c)的選擇都會(huì)對(duì)HBc-IsdA215-310抗原的免疫保護(hù)效果產(chǎn)生影響，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還可嘗試使用不同毒力的Saureus進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)；使用不同佐劑優(yōu)化免疫效果；更換其它種類的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫試驗(yàn)。本研究為新型Saureus疫苗研究提供參考。

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美國(guó)《Emerging Infectious Diseases》2014年第11期有關(guān)人獸共患病論文摘譯

P1803 1918年智利流感大流行期間的死亡模式\ Gerardo Chowell，Lone Simonsen，Jose Flores，等

南美洲歷史性流感大流行流行病學(xué)信息的缺乏妨礙了對(duì)整個(gè)美洲大陸及不同氣候區(qū)域流行模式的完整理解。為填補(bǔ)1918年智利流感大流行相關(guān)的死亡時(shí)空模式的空白，我們對(duì)檔案記錄進(jìn)行了回顧。我們發(fā)現(xiàn)的證據(jù)表明，同年不同時(shí)期有多流行波出現(xiàn)，1918-1921年間出現(xiàn)流行強(qiáng)度的波動(dòng)，流感相關(guān)的超額死亡高峰出現(xiàn)在1919年7-8月。所有年齡組包括50歲以上成人，與大流行相關(guān)的死亡率均升高，年輕的成年人與基線相比升高最多?？傊?，估計(jì)智利流感大流行引起的超額死亡率為0.94%，與其他拉丁美洲國(guó)家的報(bào)告率相似，而各省率值波動(dòng)相差約10倍。 大流行期間的死亡模式受宿主特異的敏感性，人口密度，基線死亡率和氣候變化的影響。

P1812 超毒力和耐多藥肺炎克雷伯菌克隆組群的基因組定義\ Suzanne Bialek-Davenet，Alexis Criscuolo，F(xiàn)lorent Ailloud，等

耐多藥和高毒力的肺炎克雷伯菌菌株不斷涌現(xiàn)，但是對(duì)應(yīng)于這些高危毒株的克隆組群(CGs)仍不能精確定義。我們的目標(biāo)是在全基因組變異的基礎(chǔ)上對(duì)肺炎克雷伯菌克隆組群進(jìn)行鑒定，并提供一個(gè)簡(jiǎn)單的生物信息工具，從基因組數(shù)據(jù)中提取毒力及耐藥基因數(shù)據(jù)。我們對(duì)48株絕大多數(shù)菌株血清型為K1和K2的肺炎克雷伯菌進(jìn)行了測(cè)序，并將其與119個(gè)可公開獲取的基因組進(jìn)行了比較。共有694個(gè)高度保守的基因納入了核心基因組多位點(diǎn)序列分型計(jì)劃中，數(shù)據(jù)聚類分析使超毒力和多耐藥克隆組群全球分布情況的精確定義得以實(shí)現(xiàn)。此外，我們創(chuàng)建了BIGSdb-Kp，在這個(gè)自由開放的數(shù)據(jù)庫中能夠從肺炎克雷伯菌基因組序列快速提取相關(guān)的醫(yī)學(xué)和流行病學(xué)信息。雖然肺炎克雷伯菌耐藥和毒力種群很大程度上不重疊，仍檢出了兼有兩者特征的菌株。

P1821 2013年麥加朝圣期間朝圣者中的呼吸道病毒和細(xì)菌\ Samir Benkouiten，Rémi Charrel，Khadidja Belhouchat，等

從麥加朝圣返回的朝圣者可能導(dǎo)致呼吸道病原體的國(guó)際傳播。2013年，對(duì)129個(gè)朝圣者離開法國(guó)前及離開沙特阿拉伯前的鼻和咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了呼吸道病毒和細(xì)菌的PCR檢測(cè)?？傮w而言，分別有21.5%和38.8%的朝圣前和朝圣后的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)一個(gè)以上病毒陽性(P=0.003)。在沙特阿拉伯期間，29.8%的參與者獲得了一個(gè)以上的病毒，尤其是鼻病毒 (14.0%)，冠狀病毒 E229 (12.4%)及H3N2甲型流感病毒 (6.2%)，無一例參與者發(fā)現(xiàn)中東呼吸綜合征冠狀病毒陽性。此外，分別有50.0% 和 62.0%朝圣前和朝圣后的標(biāo)本肺炎鏈球菌陽性 (P=0.053)。36.3%的參與者在逗留期間獲得了肺炎鏈球菌。我們的研究結(jié)果證實(shí)了在朝圣者中鼻病毒和肺炎鏈球菌的高采集率，也強(qiáng)調(diào)了對(duì)冠狀病毒E229的采集。

P1828 2010-2011年意大利人基因IV型諾如病毒抗體血清陽性率\ Barbara Di Martino，F(xiàn)ederica Di Profio，Chiara Ceci，等

基因IV型(GIV) (α粒子樣)諾如病毒 (NoVs)導(dǎo)致人及肉食性動(dòng)物，如狗和貓的感染。我們?cè)谝獯罄Y查了535份按年齡分層收集的人血清標(biāo)本，使用在人傳播的GIV.1基因型和在動(dòng)物中確定的GIV.2基因型的病毒樣顆粒，通過ELISA法來調(diào)查GIV NoV特異性IgG抗體的流行率。對(duì)兩個(gè)基因型特異抗體均進(jìn)行了檢測(cè)，不同年齡組中GIV.1流行率范圍為6.6%～44.8%，GIV.2流行率范圍為6.8%～15.1%。 這些數(shù)據(jù)與人群中GIV.1菌株流行率較高相符。GIV.2抗體分析結(jié)果提示了動(dòng)物源性NoVs 的人獸共患傳播，可能歸因于人與家養(yǎng)寵物間的相互作用。這一發(fā)現(xiàn)及近期記錄的人NoVs傳染狗，表明了人和動(dòng)物NoVs進(jìn)化關(guān)系的可能性。

P1841 美國(guó)印第安納州印第安納波利斯地區(qū)異性戀性伴侶中的新型沙眼衣原體\ Byron E. Batteiger，Raymond Wan，James A. Williams，等沙眼衣原體導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量的性病傳播，但是缺乏可重復(fù)性和精確的菌株分型以建立伴侶間的關(guān)聯(lián)。為此我們通過檢測(cè)序列分型(STs)和單基因分型標(biāo)準(zhǔn)ompA基因分型的一致性來評(píng)估多位點(diǎn)序列分型(MLST) 。我們對(duì)2000年4月到2003年10月間收集自美國(guó)印第安納州印第安納波利斯地區(qū)，自報(bào)在過去30 d內(nèi)建立了異性戀性伴侶關(guān)系

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,通遼 028000; 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所,通遼 028000; 3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室,通遼 028000 Email:jilinbl@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.020

R378.1

A

1002-2694(2015)01-0092-04

2014-07-22；

2014-11-19

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(No.2011BS0401),內(nèi)蒙古民族大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(No.BS280)