章域震，王 勇，楊衛(wèi)紅，朱向暉，皮自林，馮 云，何麗芳，張海林，張麗娟

云南省曲靖市嚙齒動物的立克次體血清學和分子流行病學調(diào)查

章域震1，王 勇2，3，楊衛(wèi)紅1，朱向暉4，皮自林4，馮 云1，何麗芳4，張海林1，張麗娟2

目的 調(diào)查云南省曲靖市嚙齒動物感染立克次體狀況。方法 用鼠籠法捕鼠，采集鼠血清和脾臟。用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測鼠血清中7種常見立克次體的IgG抗體；用巢氏PCR方法檢測鼠脾中嗜單核細胞埃立克體和嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因片段部份序列。結(jié)果 2012年7-9月在曲靖市捕獲嚙齒動物3種592只，褐家鼠(Rattusnorvegicus)和黃胸鼠(Rattusflavipectus)構(gòu)成比分別為61.49%和35.47%。鼠血清中貝氏柯克斯體(Coxiellaburentii)、莫氏立克次體(Rickettsiatyphi)、恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)、西伯利亞立克次體(Rickettsiasibirica)、嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)和嗜單核細胞埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)的抗體陽性率依次為21.45%、7.60%、7.09%、3.38%、1.18%和0.51%；未檢測到貓立克次體(Rickettsiafelis)抗體。從5份褐家鼠脾臟標本中檢測到16S rRNA基因序列，同源性和進化分析表明，1株為嗜吞噬細胞無形體，4株為莫氏立克次體。結(jié)論曲靖市嚙齒動物中存在莫氏立克次體和人粒細胞無形體流行，褐家鼠可能是主要宿主；同時還存在恙蟲病東方體、貝氏柯克斯體、斑點熱立克次體和埃立克體的感染。當?shù)丶部睾歪t(yī)療機構(gòu)應(yīng)加強立克次體病的監(jiān)測。

嚙齒動物；立克次體；血清學；莫氏立克次體；無形體；16S rRNA

立克次體病是由立克次體目細菌引起的一類人獸共患傳染病，病原體通過蜱、螨、蚤等節(jié)肢動物媒介叮咬人和宿主動物而傳播，有的也可通過宿主動物的分泌物和排泄物而傳播。在自然循環(huán)中，許多哺乳動物，尤其是嚙齒動物，起著貯存宿主和擴散宿主的作用。

最初，立克次體目包括所有的專性胞內(nèi)共生性細菌。隨著遺傳分析方法的發(fā)展，現(xiàn)行的分類發(fā)生了變化，一些種已從該目中移除，最著名的，當屬Q(mào)熱的病原體貝氏柯克斯體(Coxiellaburentii)[1-2]。就與人類疾病的關(guān)系而言，該目名下有立克次體科(Rickettsiaceae)和無形體科(Anaplasmataceae)。除了立克次體屬，前者還包括恙蟲病東方體屬。無形體科共有6屬，其中無形體屬的嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)和埃立克體屬的嗜單核細胞埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)可引起人類嚴重疾病。 近20多年，一些新種被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，多種動物立克次體病原體被證實能引起人類疾病[2-3]。

在中國，迄今至少有9種立克次體病原體被分得[4]。云南省位于中國亞熱帶地區(qū)，毗鄰東南亞；河谷眾多、良好的森林覆蓋率為立克次體病的主要儲存宿主嚙齒動物和媒介提供了適宜的生存環(huán)境。以往曾從該省病人和動物中發(fā)現(xiàn)9種立克次體病的血清學證據(jù)，以及在病原學和基因序列上證實了莫氏立克次體(Rickettsiatyphi)、普氏立克次體(Rickettsiaprowazeki)、恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)、貝氏柯克斯體、嗜吞噬細胞無形體和嗜單核細胞埃立克體的存在[5-7]。然而，云南省東部地區(qū)尚缺乏立克次體病分布的資料。為拓展認識這些疾病在云南的地理分布情況，我們在曲靖市進行了家鼠自然感染常見立克次體的調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 鼠類標本采集 2012年7-9月，在云南省曲靖市所轄9個縣(市、區(qū))(圖1)居民區(qū)用籠夜法捕鼠，捕獲鼠類經(jīng)分類鑒定、編號登記后，股動脈采血并分離血清，解剖取脾臟組織，分別放入2 mL凍存管內(nèi)，暫存當?shù)谻DC的-20 ℃冰箱，液氮運輸和保存。用二氧化碳干冰航空運輸?shù)奖本┲袊膊☆A(yù)防控制中心(CDC)傳染病預(yù)防控制所檢測。

Fig.1 Geographical location of the studied counties of Qujing Prefecture

1.2 間接免疫熒光試驗 用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測鼠血清中7種立克次體IgG抗體?？乖芍袊鳦DC傳染病預(yù)防控制所立克次體室制備。嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophilum,RA2682,lot03-0403N)和嗜單核細胞埃立克體(E.chaffeensis, Arkansas strain) 的菌株來自美國CDC，莫氏立克次體(R.typhi, Wilmington strian)、西伯利亞立克次體(R.sibirica, Malish 7 strain)，貓立克次體(R.felis,URRWXCal2 strain)、恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi,types Kato)和貝氏柯克斯體(C.burnetii， Nine Mile strain)的菌株由世界衛(wèi)生組織立克次體合作中心提供。血清稀釋至1∶80，20 μL的稀釋血清加至制備好的抗原片，置濕盒37 ℃孵育1 h，用PBS(pH7.4)振洗。風干后，加羊抗鼠熒光標記抗體(美國KPL公司，LOT no.130481)，重復孵育和清洗步驟。滴加甘油后鏡檢。陽性結(jié)果判斷以帶綠色熒光細菌數(shù)或含包涵體的細胞數(shù)等于或超過陽性對照1/4為標準。結(jié)果的確認要求兩名獨立的鏡檢實驗技術(shù)人員。IgG抗體滴度1∶80為陽性，1∶80為公認的具有診斷價值的滴度[8]。

1.3 PCR試驗 采用巢氏PCR擴增鼠脾臟組織中嗜吞噬細胞無形體和嗜單核細胞埃立克體的16S rRNA基因部份片段[9]。外引物為Eh-out(AF414399): 5′ - TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG- 3′和5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCT-3′。嗜單核細胞埃立克體的內(nèi)引物為：5′-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3′ 和5′ -TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3′；嗜吞噬細胞無形體內(nèi)引物為：5′-GTCGAACGGATTCTTTATAGCTTG-3′和5′-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAC-3′。最終的擴增產(chǎn)物大小為389 bp。使用QIAamp組織試劑盒(QIAGEN, Germany)提取DNA。第一次與第二次PCR反應(yīng)條件相同：94 ℃ 45 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 60 s; 39次循環(huán)。每輪PCR開始時，預(yù)變性94 ℃ 5 min，結(jié)束時總延伸5 min。陽性產(chǎn)物在北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司雙向測序完成。從GenBank引用40株相關(guān)立克次體核酸序列(圖2)，用ClastalX1.83軟件進行核苷酸序列比對，用Mega.5軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

2 結(jié) 果

2.1 嚙齒動物分布 在曲靖市9個縣(市、區(qū))共捕獲嚙齒動物3種592只，其中褐家鼠(Rattusnorvegicus)364只，占61.49%；黃胸鼠(R.flavipectus)210只，占35.47%；小家鼠(Musmusculus)14只，占2.36%；4只未鑒定鼠種。褐家鼠和黃胸鼠均為曲靖市各縣(市、區(qū))居民區(qū)的優(yōu)勢鼠種。每個縣(市、區(qū))捕鼠約65只，所有捕獲鼠均采集到血清和脾臟。

2.2 立克次體IgG抗體檢測 采用IFA法，用7種立克次體抗原片檢測592份鼠血清，結(jié)果貝氏柯克斯體IgG抗體陽性率最高(21.45%)，包括了所有的縣(市、區(qū))；其余按陽性率高低分別是莫氏立克次體(7.60%)、恙蟲病東方體(7.09%)、西伯利亞立克次體(3.38%)、嗜吞噬細胞無形體(1.18%)和嗜單核細胞埃立克體(0.51%)；沒有檢測到貓立克次體抗體(表1)。除貓立克次體和嗜單核細胞埃立克體，無論黃胸鼠和褐家鼠均不同程度的存在其它5種立克次體感染(表2)。

592份血清中，42份(7.09%)存在血清學的交叉反應(yīng)(表3)，以貝氏柯克斯體表現(xiàn)最明顯。114份貝氏柯克斯體陽性血清中，共有41份與其它種類抗原發(fā)生血清學的交叉反應(yīng)或病原體雙重或多重感染的可能性。

表1 曲靖市嚙齒動物血清中7種立克次體IFA檢測結(jié)果

Tab.1 IFA results of antibodies in murine sera against six etiologic agents ofRickettsiaceaeandAnaplasmatanceaeand againstC.burnetii

Note: *--The figures outside brackets represent the positive number; the figures in the outside represent the positive rate (%).

Note: *--The figures outside brackets represent the positive number; the figures in the outside represent the positive rate (%). **--R.t,R.s,O.t,C.b,A.p,E.candR.fare the abbreviations ofR.typhi,R.sibirica,O.tsutsugamushi,C.burentii,A.phagocytophilum,E.chaffeensisandR.felis, respectively.

表3 曲靖市嚙齒動物血清中7種立克次體抗體檢測的交叉反應(yīng)或雙重感染數(shù)據(jù)列表

Tab.3 Serological cross-reactions or possible co-infections among seven bacterial pathogens used for detection of antibodies in murine sera

Note: *--The denominator indicates the antibody-positive number of the causative agent showed in the row; the numerator indicates the number of sera with cross reaction or co-infections between the causative agent in the row and the one in the column.

2.3 立克次體核酸檢測和序列分析 所有鼠脾標本均進行巢氏PCR擴增和產(chǎn)物測序，結(jié)果獲得4份莫氏立克次體的16S rRNA基因部分序列(YNLP2、YNLP41和YNLP66株來自羅平縣褐家鼠，YNZY12株來自沾益縣褐家鼠)；1份嗜吞噬細胞無形體的16S rRNA部分序列(YNQL10，麒麟?yún)^(qū)褐家鼠)。YNLP2、YNLP41、YNLP66和YNZY12之間的核苷酸序列無差異，與莫氏立克次體代表株Wilmington株核苷酸同源性高達99.4%；系統(tǒng)進化樹分析，它們與Wilmington株處于同一進化分支，而與普氏立克次體、恙蟲病東方體和斑點熱立克次體菌株進化關(guān)系較遠(圖2A)。YNQL10株與其它嗜吞噬細胞無形體株核苷酸同源性≥99.4%；進化分析表明，YNQL10株與先前從云南灰腹鼠(Niviventereha)中得到的嗜吞噬細胞無形體核苷酸序列(FJ968655)進化關(guān)系最近，與中國中東部和東北部、美國，歐洲和日本獲得的菌株處于同一進化分枝(圖2B)，而與來自湖北山羊、廣西山麂和日本鹿中的菌株進化關(guān)系較遠。結(jié)果表明，曲靖市褐家鼠中存在莫氏立克次體和嗜吞噬細胞無形體感染。

3 討 論

以往調(diào)查表明，云南省存在恙蟲病、鼠型斑疹傷寒、流行性斑疹傷寒、Q熱和斑點熱等立克次體病[5]，然而，它們主要分布在云南省南部和西部相對低海拔地區(qū)和江河峽谷地區(qū)。曲靖市位于云南省東部，與貴州省相連，屬云貴高原中心地區(qū)，該地不明發(fā)熱病人很常見，但有關(guān)立克次體病的既往資料幾乎空白。本次調(diào)查結(jié)果顯示，曲靖市家鼠中普遍存在多種立克次體的感染，其中以地方性(鼠型)斑疹傷寒病原體莫氏立克次體的抗體陽性率最高(7.09%)。但這個陽性率要遠低于云南以往家鼠的調(diào)查(48%，1983；41.36%，2007)[10-11]。近幾年鼠型斑疹傷寒在云南省部分地區(qū)常有暴發(fā)[12]，一些地區(qū)健康人血清抗體陽性率也較高(15.41%)[8]。這些情況表明，地方性斑疹傷寒在云南省分布十分廣泛，本次從位于高原地區(qū)的曲靖褐家鼠中檢測到4份莫氏立克次體基因序列，進一步支持這一結(jié)論。

A:R.typhi; B:A.phagocytophilum

圖2 16S rRNA基因部份核苷酸片段的系統(tǒng)進行樹分析

Fig.2 Phylogenetic analyses of partial sequences of 16S rRNA gene

20世紀90年代初，從采集自內(nèi)蒙的蜱標本中，西伯利亞立克次體在中國得到首次證實[13]；1998年，南方福建省檢測到核酸片段[14]；2002年，廣東省分離到病原體[15]。在云南，雖然鼠和蜱中曾檢測到斑點熱群立克次體核酸(未確定至種)和病人中曾檢測到斑點熱群抗體[16]，但未見分離到西伯利亞立克次體的報告。本研究從曲靖市5個縣的鼠血清中，查到西伯利亞立克次體抗體，其中，麒麟?yún)^(qū)和羅平縣陽性率分別為9.23%和14.93%，提示該病原體在曲靖家鼠中存在感染。然而，斑點熱群立克次體中包含的種類較多，它們之間或與屬內(nèi)其它立克次體間可能存在著血清學交叉，因此，尚需獲得病原體或基因序列的證據(jù)。

恙蟲病是已證實的云南分布最廣的立克次體病[5]。本研究中褐家鼠和黃胸鼠的恙蟲病東方體抗體陽性率分別為4.95%和10.00%，后者明顯高于前者，早年的資料顯示云南黃胸鼠是地里纖恙螨的主要寄主[5]。貓立克次體為蚤傳斑點熱立克次體，是近20多年來新發(fā)現(xiàn)的可感染人的的立克次體，其分布區(qū)在擴大，主要貯存宿主和傳播媒介是貓蚤[17]。本次未從曲靖家鼠血清中檢測到抗體，提示該地區(qū)的鼠蚤并非貓立克次體的宿主。

直到1986和1990年，嗜吞噬細胞無形體和嗜單核細胞埃立克體引起的人類疾病(分別稱為人粒細胞無形體病和人單核細胞埃立克體病)才得到清晰的認識。它們的貯存宿主種類似乎很廣泛。本次從曲靖4個縣的鼠血清中檢測到嗜吞噬細胞無形體抗體，還從褐家鼠中檢測到該病原體的基因序列，表明當?shù)丶沂笾写嬖谠摬≡w的流行。2000年，Cao等用PCR方法在福建和云南勐臘縣的蜱中發(fā)現(xiàn)嗜單核細胞埃立克體的核酸[7]，2012年，Meng等對新疆的蜱的檢測也得到同樣的結(jié)果[18]。本次從富源縣鼠血清中檢測到嗜單核細胞埃立克體抗體，提示當?shù)厥笕褐锌赡艽嬖谠摬≡w流行。

立克次體屬內(nèi)或?qū)僦g血清學的交叉反應(yīng)普遍存在，單獨的血清學證據(jù)，正如Parola所說，只是對病原體存在的一種推測，而不是證明[1]。在表4中，我們列出了病原體之間發(fā)生交叉反應(yīng)或雙重感染的可能性。雖然存在貝氏柯克斯體與多種立克次體發(fā)生交叉反應(yīng)的報告[20]，但鑒于該病原體的傳播途徑的特殊性，即污染性土壤和動物排泄物所導致的氣溶膠傳播方式[21]，我們認為，在貝氏柯克斯體與其它病原體呈“交叉”陽性的鼠血清中，雙重感染的可能性更大。本次貝氏柯克斯體在鼠血清中陽性率較高(19.26%，114/592)，以及114份陽性標本中41份標本與其它立克次體呈交叉陽性，并不意外。Jennifer等曾針對嗜吞噬細胞無形體IFA方法的特異性進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)其與恙蟲病東方體的血清抗體不發(fā)生反應(yīng)[22]，本研究中也顯示同樣的結(jié)果。

在宿主動物血清學證據(jù)的基礎(chǔ)上，從宿主中檢測到病原體的基因序列或分離到病原體，是判斷宿主-病原體-媒介循環(huán)存在與否的重要依據(jù)。曲靖市592份鼠脾標本中，檢測到4份莫氏立克次體和1份嗜吞噬細胞無形體基因序列。因此，我們推斷曲靖市至少存在這兩種立克次體的疫源地。16S rDNA是非常保守的基因[3]，這可能是本次用嗜吞噬細胞無形體和嗜單核細胞埃立克體的16S rDNA引物擴增到莫氏立克次體基因片段的原因。本研究提供了這兩種立克次體在當?shù)卮嬖诘姆肿由飳W證據(jù)。它們在媒介-宿主動物中的自然循環(huán)及與人類疾病關(guān)系，是未來應(yīng)該側(cè)重的研究方向。

致謝：曲靖市宣威、沾益、麒麟、馬龍、陸良、會澤、羅平、師宗、富源縣(市、區(qū))疾病預(yù)防控制中心在捕鼠工作中給予大力支持，特此致謝！

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Seroprevalence and molecular biological investigation of commonly knownRickettsiaspecies in rodents in Qujing Prefecture, Yunnan Province, China

ZHANG Yu-zhen1,WANG Yong2,3,YANG Wei-hong1,ZHU Xiang-hui4,PI Zi-lin4,FENG Yun1,HE Li-fang4,ZHANG Hai-lin1,ZHANG Li-juan2

(1.YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention/YunnanProvincialCenterofVirusandRickettsiaResearch,Dali671000,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;4.QujingPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Qujing655000,China)

To investigated the prevalence ofRickettisaspecies in rodents in Qujing Prefecture, Yunnan Province, cage traps were used to capture rodents alive and sera and spleens were collected. Indirect immunoinfluscent assay (IFA) was used to detect the presence of IgG antibodies induced by 7 bacterial pathogenic agents, including the commonly knownRickettisaspecies ofR.typhi,R.sibirica,R.felis, andOrientiatsutsugamushi. Nested PCR was employed to amplify the 16S rRNA gene for detectingAnaplasmaphagocytophilumandEhrlichiachaffeensis. A total of 592 rodents were collected between July-September, 2012.RattusnorvegicusandRattusflavipectusaccounted for 61.49% (364) and 35.47% (210), respectively. Positive rates ofCoxiellaburentii,R.typhi,O.tsutsugamushi,R.sibirica,A.phagocytophilumandE.chaffeensisantibodies were 21.45%, 7.60%, 7.09%, 3.38%, 1.18% and 0.51%, respectively. No antibody ofR.feliswas detected. The partial sequence of the targeted 16S rRNA was detected from 5 spleens specimens ofRattusnorvegicus. Phylogenetic analyses showed that 1 amplicon wasA.phagocytophilumand 4 wereR.typhi.A.phagocytophilumandR.typhiexisted in local rodents andRattusnorvegicusis the potential reservoir host. The prevalence ofCoxiellaburentii,O.tsutsugamushi,R. sibirica andE.chaffeensiswere also suggested. Efforts to survey these pathogenic agents should be reinforced by local public health and medical sectors.

rodent;Rickettsiaspecies; serology;Rickettsiatyphi;Anaplasmaphagocytophilum; 16S rRNA

s: Zhang Hai-lin, Email: zhangHL715@163.com; Zhang Li-juan, Email: zhanglijuan@icdc.cn

國家基礎(chǔ)研究973項目(2010CB530206; 2012CB722501)(章域震和王勇同等貢獻)

張海林，Email：zhangHL715@163.com; 張麗娟，Email：zhanglijuan@icdc.cn

1.云南省地方病防治所/云南省病毒立克次體研究中心，大理 671000； 2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制中心，北京 102206； 3.新疆石河子大學動物科技學院，石河子 832000； 4.曲靖市疾病預(yù)防控制中心，曲靖 655000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.008

R513

A

1002-2694(2015)01-0035-06

2014-06-18；

2014-10-27

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program-Nos. 2010CB530206 and 2012CB722501)