□楊 梅 趙瑞亭

紅花中羥基紅花黃色素A(簡(jiǎn)稱羥基紅花素)是紅花主要的活性成分，是查耳酮類化合物，具有擴(kuò)張冠脈、抗氧化、保護(hù)心肌、降血壓、免疫抑制及腦保護(hù)等多種藥理學(xué)功效，是用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病的有效藥物。目前其臨床劑型為注射劑，口服劑型未見(jiàn)報(bào)道，其口服吸收程度及具體的吸收機(jī)制還不明確。但在許多口服中藥復(fù)方制劑中以紅花浸膏為原料，很多證據(jù)顯示羥基紅花黃色素A對(duì)多種疾病的治療有益，證實(shí)了羥基紅花黃色素A 口服吸收的可能性。

Caco-2 細(xì)胞(the human colon adenocarcinoma cell lines 的簡(jiǎn)稱)模型是最近十幾年來(lái)國(guó)外廣泛采用的一種研究藥物腸吸收的體外模型，在吸收過(guò)程研究中，比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，應(yīng)用范圍較廣。目前利用Caco-2 細(xì)胞模型研究了許多化學(xué)合成藥的吸收機(jī)制，對(duì)中藥及有效成分的研究也有一些進(jìn)展，但對(duì)紅花或羥基紅花黃色素A 的研究未見(jiàn)報(bào)道，用Caco -2 模型研究羥基紅花黃色素A 的吸收機(jī)制，有助于為口服羥基紅花黃色素A 劑型設(shè)計(jì)、處方和工藝的篩選提供依據(jù)，具有理論意義和實(shí)用價(jià)值。

一、材料

(一)細(xì)胞株。Caco -2 細(xì)胞(code HTB037，ATCC，American Type Culture Collection，Rockville，MD)。實(shí)驗(yàn)中所用代數(shù)在40 到50 代之間。

(二)主要試劑。羥基紅花黃色素A 購(gòu)自山東綠葉;MEM/EBSS NEAA 培養(yǎng)基、0．25%胰酶消化液、胎牛血清、丙酮酸鈉(11．0mg/ml)購(gòu)自Hyclone 公司;N -2 -羥乙基哌嗪- N’-2乙磺酸鈉(Hepes)、L-谷氨酰胺、青、鏈霉素購(gòu)自南京博全科技有限公司;碳酸氫鈉分析純購(gòu)自上海虹光化工廠;維拉帕米購(gòu)自連云港恒瑞制藥廠。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)。Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)在T -75 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為MEM/EBSS NEAA，在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中全濕度培養(yǎng)。細(xì)胞接種24 小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以去除死細(xì)胞殘?jiān)?。以后隔日換液，約5天后細(xì)胞融合達(dá)90%后傳代，用37℃預(yù)熱的消化液(胰蛋白酶(0．05%)+EDTA﹒2Na(0．53 mmol/L ))在室溫下消化2～3 分鐘，傳代比率1:3。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種在24 孔Millicell 插入式培養(yǎng)皿中，接種密度7 ×104個(gè)/mL，每孔400 μL，基底側(cè)加入培養(yǎng)液600 μL，接種24 小時(shí)后更換培養(yǎng)液，接下來(lái)一周隔天換液，一周后每日換液。細(xì)胞培養(yǎng)21天后待用，以跨膜電阻作為細(xì)胞單層形成的指標(biāo)，電阻≥600Ω·cm2時(shí)，便可以開(kāi)始用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

(二)AP→BL 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。用生長(zhǎng)了21～24天的符合上述條件的Caco-2 細(xì)胞單層來(lái)研究羥基紅花黃色素A 在Caco -2細(xì)胞單層上的轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)前用pH7．4 T．M．溶液輕輕沖洗2～3次(每孔800μL ，頂側(cè)300μL，基底側(cè)500μL)，然后用pH7．4 T．M．溶液于37℃浸泡30min，以除去細(xì)胞表面的附著物。小心吸去孔內(nèi)T．M．溶液，在頂側(cè)加入T．M．溶液配制的供試液400μL，基底側(cè)加入600μL 空白pH7．4T． M． 溶液或含抑制劑的pH7．4T．M．溶液作為接收液。置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中，于給藥30、60、90、120、150min 于下層取樣150μL，并補(bǔ)充空白pH7．4 T．M．溶液。每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔。樣品-20℃保存，待測(cè)。

(三)BL→AP 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。同上法洗滌Caco -2 細(xì)胞單層，在基底側(cè)加入T．M．溶液配制的供試液600μL，頂側(cè)加入400μL空白pH7．4T．M．溶液或含抑制劑的pH7．4T．M．溶液作為接收液。置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中，于給藥30、60、90、120、150min 于頂側(cè)取樣150μL，并補(bǔ)充空白T． M． 溶液。每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔(即n=3)。樣品-20℃保存，待測(cè)。

(四)攝取實(shí)驗(yàn)。胰酶消化的細(xì)胞，用4℃的pH7．4T．M．溶液沖洗3 次(每孔800μL ，頂側(cè)300μL，基底側(cè)500μL)，以終止Caco-2 細(xì)胞攝取。在攝取了羥基紅花黃色素A 的Caco -2 細(xì)胞中加入蒸餾水(每孔500μL，頂側(cè)200μL，基底側(cè)300μL)，于-70℃、37℃反復(fù)凍融3 次，破碎細(xì)胞。-20℃保存，待測(cè)。

(五)羥基紅花黃色素A 轉(zhuǎn)運(yùn)或攝取樣品的測(cè)定。轉(zhuǎn)運(yùn)樣品12，000rpm 離心10min，取上清液HPLC 法測(cè)定濃度。

攝取樣品用過(guò)濾器(孔徑0．22μm)過(guò)濾，12，000rpm 離心10min，取上清液HPLC 法測(cè)定濃度。

液相條件:色譜柱:島津shim-pack CLC-ODS 柱(150mm×6mm，5μm);流速:0．8 m l·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):403nm;柱溫:40℃。流動(dòng)相:甲醇-乙腈-1．2%KH2PO4水溶液(24:2:74)。

羥基紅花黃色素A 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:經(jīng)高效液相分析，以樣品中羥基紅花黃色素A 量為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0．3262X-0．0435，R2=0．9992，羥基紅花黃色素A 在0．57～660 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相應(yīng)峰面積為1．85～2050．8;精密度、樣品穩(wěn)定

性考察均符合規(guī)定。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(一)不同pH對(duì)羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。分別用pH4、5、6 和7．4 含200μg·ml-1 羥基紅花黃色素A 濃度的供試液，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。在pH7．4～pH4 范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp 為1．5 ×10-8±1．10 ×10-8～1．10 ×10-7±0．12 ×10-7cm·s-1(n =3)，隨pH 的降低而顯著性增加，在pH5～6之間有極顯著性增大，pH低于5 時(shí)，Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值有明顯下降。表明羥基紅花黃色素A 在Caco-2 單層細(xì)胞模型的滲透性與pH 有關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同PH 的200μg·ml-1 Hya對(duì)Caco-2 轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

圖2 不同濃度的Hya對(duì)Caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響

(二)濃度對(duì)羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響。當(dāng)pH6 時(shí)，AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp 無(wú)顯著性差異，即無(wú)濃度依賴性。表明在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)羥基紅花黃色素A 以被動(dòng)擴(kuò)散為主。在同一濃度范圍內(nèi)，BL→AP方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp 在整個(gè)濃度范圍內(nèi)也無(wú)顯著性變化。在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)在0．59～1．10之間，表明羥基紅花黃色素A 在BL→AP與AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)速度是接近的(圖2)。攝取實(shí)驗(yàn)中，在100～800μg·ml-1 的濃度范圍內(nèi)，BL→AP方向的細(xì)胞內(nèi)對(duì)羥基紅花黃色素A 的滯留量極顯著性大于AP→BL方向(圖2)。

(三)維拉帕米對(duì)羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響。在供試液和接收液中含100μmol·L-1維拉帕米時(shí)，200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)BL→AP與AP→BL方向均極顯著性增加，增加的比例相似。攝取實(shí)驗(yàn)中BL→AP的細(xì)胞內(nèi)對(duì)羥基紅花黃色素A 的滯留量極顯著性增加。而AP→BL方向的細(xì)胞攝取無(wú)顯著性變化(圖3)。

圖3 維拉帕米羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響

(四)低鈉介質(zhì)與BSO對(duì)羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。含200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 供試液和接收液中的Na+濃度降低到20μmol·L-1(用K+調(diào)節(jié)至等滲)，羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)顯著性降低(Figure10)。當(dāng)200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 供試液和接收液中加入500μmol·L-1BSO 時(shí)，羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)無(wú)顯著性變化(圖5)。

圖4 低鈉介質(zhì)與BSO對(duì)羥基紅花黃色素A 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

四、討論

常用中藥紅花為菊科一年生草本植物紅花的干燥管狀花，始載于《開(kāi)寶本草》，在我國(guó)已有兩多年的栽培與用藥歷史，具有活血去瘀、通經(jīng)止痛之功效。紅花中羥基紅花黃色素A(簡(jiǎn)稱羥基紅花素)是紅花主要的活性成分，是查耳酮類化合物，具有擴(kuò)張冠脈、抗氧化、保護(hù)心肌等多種藥理學(xué)功效。目前其臨床劑型為注射劑，其口服吸收程度及具體的吸收機(jī)制還不明確。研究羥基紅花素的口服劑具有重要的臨床意義。

體外模型被廣泛用于闡明藥物分子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及確定某些影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)特性的結(jié)構(gòu)特征。在本研究中采用了不同介質(zhì)PH 值、濃度、維拉帕米、低Na 介質(zhì)、丁硫氨酸亞砜胺(BSO)對(duì)羥基紅花黃色素A 在Caco -2 細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH7．4～pH4 范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)有顯著性增大，在pH5～6之間有極顯著性增大，表明羥基紅花黃色素A 在Caco -2 單層細(xì)胞模型的滲透性與pH 有關(guān)。pH6 時(shí)，在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp 無(wú)顯著性差異，即無(wú)濃度依賴性。表明在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)羥基紅花黃色素A 以被動(dòng)擴(kuò)散為主。當(dāng)供試液和接收液中含100μmol·L-1維拉帕米時(shí)，羥基紅花黃色素A 由AP→BL方向Papp 極顯著性增加，證明在AP 細(xì)胞膜上存在P-gp 外排。羥基紅花黃色素A 由BL→AP方向細(xì)胞內(nèi)滯留顯著性增加，可能與P -gp 外排被抑制有關(guān)。當(dāng)供試液和接收液中含500μmol·L-1BSO 時(shí)，羥基紅花黃色素A 的Papp 在AP→BL方向無(wú)顯著性變化。表明羥基紅花黃色素A在腸道的吸收不受MRP2 外排的影響。當(dāng)供試液和接收液中的Na+濃度從154 mmol·L-1降低到20mmol·L-1(用K+調(diào)節(jié)至等滲)時(shí)，低濃度的Na +可以導(dǎo)致SGLT1 活性降低，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速度減慢。羥基紅花黃色素A 轉(zhuǎn)運(yùn)速度顯著性降低，表明其吸收與SGLT1 有關(guān)。

本文研究并未結(jié)合劑型因素，但若可以結(jié)合劑型因素，有望為口服羥基紅花素劑型設(shè)計(jì)、處方和工藝的篩選提供依據(jù)。因此Caco-2 細(xì)胞模型在中藥口服吸收研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。