李 昊 亓建洪

玻璃化冷凍保存法及其在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)軟骨組織保存的應(yīng)用

李 昊 亓建洪

隨著低溫保存技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步, 玻璃化保存技術(shù)和方法已被廣泛地用于各種生物材料的低溫 保存中。玻璃化冷凍法在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)軟組織(比如關(guān)節(jié)軟骨、肌腱組織)移植方面有廣闊的應(yīng)用前景, 并為其相應(yīng)的組織庫(kù)保存提供技術(shù)保障, 在組織修復(fù)中起到重要作用。

玻璃化冷凍保存；軟骨；關(guān)節(jié)；成活率

隨著低溫保存技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步, 學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在深低溫環(huán)境中的離體生物材料會(huì)逐漸減緩其新陳代謝的速度, 嚴(yán)重的停止新陳代謝, 因此能夠得以長(zhǎng)期保存。低溫儲(chǔ)存技術(shù)包括快速降溫法、連續(xù)慢速降溫法、梯度降溫法、程序性降溫法、玻璃化凍存技術(shù)等。玻璃化冷凍保存法自被人們發(fā)明至今一直都是在此領(lǐng)域內(nèi)的專家所研究的焦點(diǎn)話題［1］。

1 玻璃化冷凍保存法

生物材料(細(xì)胞、組織、器官) 脫離供體后實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的保存很難。伴隨著低溫保存技術(shù)的不斷發(fā)展, 學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在深低溫環(huán)境中的離體生物材料會(huì)逐漸減緩其新陳代謝, 嚴(yán)重的停止新陳代謝, 因此能夠使其得以長(zhǎng)期保存。玻璃化冷凍保存法自被人發(fā)明至今一直都是低溫保存領(lǐng)域內(nèi)的專家所研究的焦點(diǎn)話題。由于科技進(jìn)步, 隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展, 玻璃化保存技術(shù)和方法已廣泛地用于各種生物材料的低溫保存中。

玻璃化冷凍保存技術(shù)里面所述的“玻璃化”是著眼于物理層面所定義的, 即在短時(shí)間內(nèi)降低液體的溫度, 使其變成玻璃體(非晶體固態(tài))。影響玻璃化保存的主要因素包括冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agents, CPAs)的種類及濃度、降溫速率、升溫速率和儲(chǔ)存溫度等。要實(shí)現(xiàn)玻璃化的關(guān)鍵是需要極快的降溫速率和較高濃度的CPAs 。當(dāng)前一共有50多種冷凍保護(hù)劑是運(yùn)用比較廣泛的, 一共有3個(gè)類別。CPAs 的的挑選是非常關(guān)鍵的, 運(yùn)用在玻璃化冷凍保存的CPAs濃度要比另外一些諸如程序性降溫的凍存工藝濃度更高。研究得知［2］, CPAs溶液的濃度與在相同時(shí)間范圍內(nèi)低溫保護(hù)劑所滲進(jìn)軟骨內(nèi)部的劑量呈現(xiàn)正向關(guān)聯(lián), 但CPAs的濃度越高, 意味著對(duì)軟骨會(huì)造成越大的損傷, 毒性非常大。科學(xué)分配CPAs, 讓它不僅僅發(fā)揮其玻璃化與穿透性作用,而且還可以減輕冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞可能造成的傷害。玻璃化冷凍保存技術(shù)為組織器官的長(zhǎng)期保存提供更為廣闊的前景, 玻璃化冷存工藝能夠使得原本生物細(xì)胞活性、完整性得以維持, 抗原性得以縮減。如今, 美國(guó)紅十字會(huì)已經(jīng)對(duì)CPAs的成分表示了認(rèn)可, 允許運(yùn)用其來(lái)保存人體組織器官［3］, 到現(xiàn)在, 在人精子、紅細(xì)胞單核細(xì)胞、胰島等的保存中得以廣泛的運(yùn)用［4］。

2 玻璃化冷凍保存法在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)骨關(guān)節(jié)組織保存的應(yīng)用

2.1 關(guān)節(jié)軟骨組織的玻璃化冷凍保存 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常普遍的病變就包括了軟骨損傷與缺損, 缺損后軟骨不具有較好的自身修復(fù)與重建能力, 假若治療不及時(shí), 會(huì)使得軟骨出現(xiàn)嚴(yán)重的退變［5］。關(guān)節(jié)軟骨包括了諸多細(xì)胞外基質(zhì)(占據(jù)比重為98%～99%)與少部分的軟骨細(xì)胞, 細(xì)胞外基質(zhì)的成分包括水、膠原與蛋白多糖、糖蛋白與一些其他類別的蛋白。關(guān)節(jié)軟骨含有豐富的水分, 占據(jù)了65%～80%的濕重比。關(guān)節(jié)軟骨不具有神經(jīng)支配與血液、淋巴供應(yīng), 相對(duì)來(lái)說(shuō)它的細(xì)胞密度與活性都非常低, 所以軟骨一直往往不會(huì)導(dǎo)致劇烈的免疫反應(yīng)［6］。因此, 軟骨病變最長(zhǎng)運(yùn)用的修復(fù)手段就是關(guān)節(jié)軟骨移植。相關(guān)研究得知, 假若并未對(duì)軟骨實(shí)施低溫處理, 常溫狀態(tài)下軟骨只可以保存2 h, 軟骨在3 h之后其排列出現(xiàn)紊亂, 形成了非常多的裂隙［7］；鮮活的軟骨移植物沒(méi)有廣泛的來(lái)源, 會(huì)出現(xiàn)免疫排斥、移植軟骨易被吸收［8］。因此如今很多的專家都將注意力集中在冷凍軟骨移植技術(shù), 期望妥善處理鮮活異體軟骨移植導(dǎo)致的各種問(wèn)題。

相關(guān)研究表明［9］：通過(guò)玻璃化冷凍保存液對(duì)軟骨組織實(shí)施預(yù)處理保存之后, 軟骨組織活性得以提升, 在8周的時(shí)間內(nèi), 其存活率高達(dá)74.5%, 此外細(xì)胞基質(zhì)成分有著優(yōu)越的代謝活性, 此方法的成效非常理想。相對(duì)于緩速梯度降溫這一方法, 玻璃化法能夠?qū)⒗鋬霰４婧筌浌羌?xì)胞存活率得以明顯增強(qiáng), 軟骨基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖穩(wěn)定性得以保持, 基質(zhì)受到的損傷降低。通過(guò)玻璃化法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行體外冷凍保存能夠獲得較為理想的效果, 但其移植效果還要展開(kāi)更深入地研究。

2.2 肌腱組織的玻璃化保存 肌腱采用玻璃化冷凍保存,其細(xì)胞活性得到較好的維持, 對(duì)于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)和膠原結(jié)構(gòu)的損傷非常小, 所以在移植處理之后的肌腱細(xì)胞有著較好的生物活性, 其修復(fù)成效和鮮活的自體肌腱無(wú)異, 但相對(duì)于自體組織來(lái)說(shuō), 修復(fù)重建所耗費(fèi)的時(shí)間較多［10］。

肌腱是一種低免疫的原性組織, 肌腱細(xì)胞承擔(dān)其免疫抗原性的表達(dá)［11］。Kagabu等［12］在分析研究了卵巢玻璃化保存后, 得知組織免疫原性會(huì)在此過(guò)程中顯著下降, 可能的原理為：①低溫保存對(duì)異體抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生了抑制。②細(xì)胞膜組織主要的相容性抗原會(huì)被濃度較高的玻璃化溶液浸透和滲透性脫水所改變, 因此供體的免疫原性被縮減。

1992年, 異體肌腱移植開(kāi)始在臨床運(yùn)用［13-15］。相關(guān)研究得知, 玻璃化保存肌腱能夠使得肌腱組織抗原性得以下降,肌腱生物活性得以保存, 相對(duì)于另外一些處理方法, 移植后的痊愈速度更快, 獲得世界眾多專家學(xué)者的贊許［16］。

3 小結(jié)與展望

玻璃化法冷凍保存細(xì)胞(精子［17］、卵母細(xì)胞［18］等)在臨床上已獲得普遍的運(yùn)用, 逐漸完善了對(duì)皮膚［19］、神經(jīng)［20］、角膜［21］、心臟瓣膜［22］、血管［23］、腎臟［24］、卵巢等組織的玻璃化法保存技術(shù)［25］。同樣, 玻璃化冷凍法在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)軟組織移植方面有廣闊的應(yīng)用前景。目前, 隨著技術(shù)的發(fā)展, 自身組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)雖已成功研發(fā), 但是臨床使用較少,費(fèi)用也較昂貴, 無(wú)法得到普及發(fā)展。性價(jià)比相對(duì)較高的異體組織移植技術(shù)因此得到不斷發(fā)展, 同種異體軟骨、肌腱組織來(lái)源相對(duì)較廣, 移植技術(shù)已相對(duì)成熟, 玻璃化保存技術(shù)的發(fā)展可為其相應(yīng)的組織庫(kù)保存提供技術(shù)保障, 在組織修復(fù)中起到重要作用。關(guān)節(jié)軟骨的玻璃化保存方法非常便捷、高效,由于冷凍工藝與冷凍劑獲得了進(jìn)一步發(fā)展, 有效提升了其冷凍保存效果, 發(fā)展前景非常廣闊［26］。

［1］ Rall WF, Fahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification.Nature, 1985, 313(6003):573-575.

［2］ 平安松, 劉世清.冷凍保存對(duì)軟骨細(xì)胞活性及超微結(jié)構(gòu)的影響.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2004, 9(21):1114-1115.

［3］ Brockbank KG, Chen ZZ, Song YC.Vitrification of porcine articular cartilage.Cryobiology, 2010, 60(2):217-221.

［4］ 許海峰, 劉寶林, 高志新.細(xì)胞及組織的玻璃化保存研究.低溫工程進(jìn)展, 2010(5):59-63.

［5］ Moskowitz RW.Osteoarthritis：Diagnosis and Medical/Surgical Management.4th ed.Philadelphia： Lippincott Williams & Wilkins, 2007:71-107.

［6］ Darling EM, Athanasiou KA.Biomechanical strategies for articular cartilage regeneration.Ann Biomed Eng, 2003, 31(9):1114-1124.

［7］ 王泓, 馬信龍, 張園.新鮮人關(guān)節(jié)軟骨試件在體外不同環(huán)境下退變的組織學(xué)觀察.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(15):2701-2704.

［8］ 王麗霞, 李敏, 張瑞存, 等.不同保存方法對(duì)同種異體軟骨移植修復(fù)軟骨缺損的免疫原性影響.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(53):10035-10038.

［9］ 宋洪強(qiáng), 玄燕華, 吳雅迪, 等.玻璃化冷凍法保存關(guān)節(jié)軟骨.中國(guó)組織工程研究, 2012, 16(46): 8615-8619.

［10］ 胡成棟, 劉曦, 張伯勛, 等.玻璃化法保存同種異體肌腱移植材料的可行性.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(12):2175-2178.

［11］ Guidos C, Sinha AA, Lee KC.Functional differences and complementation between dendritic cells and macrophages in T-cell activation.Immunology, 1987, 61(3): 269-276.

［12］ Kagabu S, Umezu M.Transplantation of cryopreserved mouse, Chinese hamster, rabbit, Japanese monkey and rat ovaries into rat recipients.Exp Anim, 2000, 49(1):17-21.

［13］ 李麗, 周琳瑛, 張發(fā)惠, 等.SD 大鼠肌腱冷凍維持溫度選擇的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志, 2004, 22(1):84-86.

［14］ Iancu CV, Tivol WF, Schooler JB, et al.Elect ron cryotomography sample preparat ion using the Vit robot .Nat Protoc, 2006, 1 (6) :2813-2819.

［15］ Fahy GM, Wowk B, Wu J, et al.Cryopreservation of organs by vit rification: perspectives and recent advances.Cryobiology, 2004, 48 (2) : 157-178.

［16］ Dahl SL, Chen Z, Solan AK, et al.Feasibility of vitrification as a storage method for tissue-engineered blood vessels.Tissue Eng, 2006, 12 (2) : 291-300.

［17］ Dong Q, Correa LM, VandeVoort CA.Rhesus monkey sperm cryopreservation with TEST-yolk extender in the absence of permeable cryoprotectant.Cryobiology, 2009, 58(1):20-27.

［18］ Sripunya N, Somfai T, Inaba Y, et al.A comparison of cryotop and solid surface vitrification methods for the cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes.J Reprod Dev, 2010, 56(1):176-181.

［19］ 朱兆明, 賈曉明, 柴家科, 等.玻璃化法儲(chǔ)存皮膚的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用.中華外科雜志, 1991, 29(11):705-707.

［20］ Decherchi P, Lammari-Barreault N, Cochard P, et al.CNS axonal regeneration with peripheral nerve grafts cryopreserved by vitrification: cytological and functional aspects.Cryobiology, 1997, 34(3):214-239.

［21］ Fan WX, Ma XH, Ge D, et al.Cryoprotectants for the vitrification ofcorneal endothelial cells.Cryobiology, 2009, 58(1):28-36.

［22］ Schenke-Layland K, Madershahian N, Riemann I, et al.Impact of cryopreservation on extracellular matrix structures of heart valve leaflets.Ann Thorac Surg, 2006, 81(3):918-926.

［23］ Baicu S, Taylor MJ, Chen Z, et al.Cryopreservation of carotid artery segments via vitrification subject to marginal thermal conditions: correlation of freezing visualization with functionalrecovery.Cryobiology, 2008, 57(1):1-8.

［24］ Fahy GM, Wowk B, Pagotan R, et al.Physical and biological aspects of renal vitrification.Organogenesis, 2009, 5(3):167-175.

［25］ Isachenko V, Lapidus I, Isachenko E, et al.Human ovarian tissue vitrification versus conventional freezing: morphological, endocrinological, and molecular biological evaluation.Reproduction, 2009, 138(2):319-327.

［26］ 王文良, 劉英杰, 張華亮, 等.玻璃化保存對(duì)兔肌腱組織形態(tài)學(xué)觀察.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 18(3):204-207.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.12.181

2015-03-23］

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：ZR2013HM034)

271000 泰山醫(yī)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所

亓建洪