□ 耿文一 楊 雪 唐 婷 柳峰松

一、引言

隨著抗生素的濫用和超級(jí)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，昆蟲抗菌肽已成為新型抗菌藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的重要資源。家蠅中已經(jīng)報(bào)道的抗菌肽有攻擊素(attacin)，天蠶素(cecropin)，防御素(defensin)和溶菌酶(lysozyme)［1］?？咕牡墨@得可以通過許多方法，例如采用提取純化的方式獲得，但是提取工藝繁瑣;有研究是通過真/原核表達(dá)來表達(dá)純化抗菌肽［2］，由于抗菌肽的抑菌能力較強(qiáng)，該方法的成功率較低;也有研究運(yùn)用抑制性消減雜交方法成功獲得免疫相關(guān)基因［3］。本文通過分析家蠅基因數(shù)字表達(dá)譜和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌刺激后多條未知基因表達(dá)量顯著升高。分析其中1條基因編碼的多肽發(fā)現(xiàn)具有抗菌肽的典型特征，同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí)根據(jù)其成熟肽合成的多肽具有廣譜抑菌活性。此基因是在家蠅中首次被發(fā)現(xiàn)的，并且在GenBank中找不到同源基因，將其命名為A3。

二、材料與試劑

(一)實(shí)驗(yàn)材料。家蠅Musca domestica(Linnaeus)種蠅由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所何鳳琴老師惠贈(zèng)，幼蟲由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25℃，相對(duì)濕度為50% ～70%。

(二)主要試劑。實(shí)驗(yàn)室所用試劑是TaKaRa公司產(chǎn)品，有RNAiso Plus、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD19-T載體、SYBR Green;南京金斯瑞科技有限公司產(chǎn)品有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶;蘇州金唯智生物有限公司合成引物。由上海默悉生物科技有限公司合成A3合成肽(純度大于95%)。

(三)主要菌種。攻毒實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為本實(shí)驗(yàn)室所保存。抑菌實(shí)驗(yàn)所用菌種由中科院動(dòng)物研究所朱順義研究員饋贈(zèng)。革蘭氏陽性菌:巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，脲芽孢八疊菌(Sporosarcina ureae);革蘭氏陰性菌:嗜水汽單胞菌(Aeromonas hydrophila)，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，大腸桿菌(Escherichia coli)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

(一)總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。按照使用說明書，用RNAiso Plus試劑提取家蠅幼蟲的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，利用核酸定量?jī)x測(cè)定其濃度和純度，各取1μg 總 RNA，以 AOLP(5＇-GGCCACGCGTCGACTAGTACT16(G/A/C)-3＇)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

(二)A3基因cDNA序列的克隆。參照家蠅轉(zhuǎn)錄組序列信息，設(shè)計(jì)A3基因特異正向引物A3-F1(5＇-AACCACATTACGCTAACACG-3＇)和特異反向引物 A3-R1(5＇-CATTAAATCGCGAGCCCTTTTTGA-3＇)，以家蠅幼蟲 cDNA為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為:94℃、4min;94℃、30s，55℃、40s，72℃、1min，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸，10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收后，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽性克隆后測(cè)序。

(三)A3抗菌肽的生物信息學(xué)分析。將上述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用Bioedit軟件搜索開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，翻譯成氨基酸序列。利用Signal 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找信號(hào)肽。成熟肽分子量、等電點(diǎn)及氨基酸組成在Antimicrobial Peptide Database(http://aps.unmc.edu/AP/)中預(yù)測(cè)。在NCBI網(wǎng)站上利用 Blastp程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行相似性比對(duì)。

(四)A3成熟肽合成。將A3成熟肽氨基酸序列VQRVLFPICTKGPFLHSLRDTDSLGRQLDPYVIR YQKKFGST發(fā)送到上海默悉生物科技有限公司進(jìn)行合成。

(五)A3合成肽的抑菌活性實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)菌株在37℃，220 rpm條件下震蕩過夜。將活化后的菌種以1%接種量接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600=0.2左右時(shí)，停止搖菌。將各菌株菌液用新鮮培養(yǎng)基稀釋100倍，備用。將A3合成肽用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別是1 mM、200 μM、100 μM、20 μM、2 μM、0.2 μM、20 nM 和 2 nM。

我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌菌譜進(jìn)行大范圍的檢測(cè)。取其中一株細(xì)菌的稀釋菌液加入96孔板中，每孔加入菌液90 μl;多肽稀釋液以不同的濃度分別加入細(xì)菌稀釋液中，加入量為10 μl，23℃，100 rmp 震蕩培養(yǎng) 12 h。同時(shí)以分別加入 10 μl無菌水和10 μl氨芐青霉素(0.1 g/ml)作為陰性和陽性對(duì)照組。在OD600下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌液的濁度，來判斷其是否具有抑菌活性，并測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，MIC定義為與陰性對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組達(dá)到85%以上細(xì)菌死亡的多肽濃度。所有不同濃度的樣品要進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

(六)A3合成肽的溶血活性測(cè)定。抽取1 ml的兔靜脈血，立即與阿氏液(Alsever＇s Solution)混勻。用生理鹽水洗滌血細(xì)胞，2000 rmp，離心5 min，棄上清。用50倍體積生理鹽水重懸血細(xì)胞，并以200 μl每支分裝到1.5 ml離心管中。將多肽A3用生理鹽水稀釋成濃度梯度，分別為1 mM、204 μM、102 μM、20.4 μM、2.04 μM、0.204 μM、20.4 nM 和 2.04 nM。200 μl血細(xì)胞加入 4 μl肽液，37℃孵育30 min。3000 rmp，離心5 min，收集上清，在分光光度計(jì)上測(cè)定416 nm處吸光度值。陽性對(duì)照為用生理鹽水稀釋的10%Triton-X-100;陰性對(duì)照為生理鹽水。溶血率計(jì)算方法:溶血率(%)=［(AB)/(C-B)］×100%(A:實(shí)驗(yàn)組吸光度值;B:陰性對(duì)照組吸光度值;C:陽性對(duì)照組吸光度值)。

四、結(jié)果

(一)家蠅A3基因cDNA序列及分析。經(jīng)PCR克隆，獲得家蠅A3基因cDNA序列254 bp，包含198 bp完整的開放閱讀框，5＇末端非翻譯區(qū)12 bp，3＇末端非翻譯區(qū)44 bp。推導(dǎo)的A3多肽序列由65個(gè)氨基酸殘基組成(圖1)，圖中劃線部分為信號(hào)肽。成熟肽富含Leu(11.90%)和Arg(9.52%)(圖2)，疏水性氨基酸為14個(gè)，帶正電荷的氨基酸為8個(gè)，理論分子量為4881.4 D，等電點(diǎn)為9.86。Blastp分析后未發(fā)現(xiàn)A3基因的同源性序列。

通過對(duì)抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，A3成熟肽是由β-折疊和α-螺旋構(gòu)成(見圖3)。從三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖中可以看出，在C端有1個(gè)α螺旋，N端有2個(gè)反向平行的β片層(見圖4)。

圖1 家蠅抗菌肽A3基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 A3成熟肽的氨基酸組成

(二)A3合成肽的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們用實(shí)驗(yàn)室已有的菌株來進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。A3合成肽對(duì)多種細(xì)菌都有抑制作用，其中抑制作用最高的為革蘭氏陰性菌Serratia marcescens，其MIC 為30.73 μM。

(三)A3合成肽溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，合成肽的終濃度為1 mM時(shí)，其溶血效率為19.1%，說明A3對(duì)哺乳動(dòng)物血細(xì)胞具有較低的溶血活性。

圖3 A3成熟肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖4 A3成熟肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)

五、結(jié)語

本文根據(jù)家蠅EST序列篩選到一種新型的家蠅抗菌肽A3基因，合成A3成熟肽對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有抑制作用，且?guī)缀鯖]有溶血活性，因此A3在醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定應(yīng)用潛力。本研究不但從家蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新型抗菌肽，在新抗菌肽的發(fā)現(xiàn)方法方面也有獨(dú)到之處，在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)迅速發(fā)展的今天，利用生物信息學(xué)作為指導(dǎo)，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得新基因是一種方便可行的方法，可突破生物化學(xué)方法分離蛋白的難關(guān)，會(huì)加快新型抗菌肽的研發(fā)進(jìn)程。

［1］Boman HG，F(xiàn)aye I，Gudmundsson GH，Lee JY，Lidholm DA.Cell-free immunity in Cecropia.A model system for antibacterial proteins［J］.Eur J Biochem，1991，201(1):23 ～ 31

［2］耿華，安春菊，郝友進(jìn)，李德森，杜榮騫.家蠅攻擊素(Attacin)基因的克隆與表達(dá)［J］. 遺傳學(xué)報(bào)，2004，12:1344～1350

［3］Ito Y，Nakamura M，Hotani T，Imoto T.Insect lysozyme from house fly(Musca domestica)larvae:possible digestive function based on sequence and enzymatic properties［J］.J Biochem，1995，118(3):546～551