楊黎，汪海珍*，姚志遠，吳建軍

（浙江大學環(huán)境與資源學院土水資源與環(huán)境研究所，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點開放實驗室，杭州310058）

大腸埃希菌O127:H7植物組織內生化研究概況

楊黎?，汪海珍?*，姚志遠，吳建軍

（浙江大學環(huán)境與資源學院土水資源與環(huán)境研究所，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點開放實驗室，杭州310058）

人畜共患病原菌大腸埃希菌O157：H7是一種產志賀毒素的典型菌株，人體感染后會引起出血性腹瀉和腸炎，且可并發(fā)溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜等疾病，嚴重時可致人死亡.人畜糞肥攜帶的大腸埃希菌O157：H7等病原菌可通過污灌、徑流、農田施用和昆蟲傳播等途徑進入到土壤環(huán)境中，污染種植的水果和蔬菜，使其成為傳播大腸埃希菌O157：H7的重要媒介，對公眾健康構成了嚴重威脅.大腸埃希菌O157：H7可從植物表面自身通道（如氣孔、皮孔和側根發(fā)生處等）或表面損傷（生物損傷或物理損傷等）等途徑進入植物體內，隨宿主植物的細胞分化在植物體內繁殖，與宿主植物構成特殊的共生關系，但不形成特殊結構，也不引發(fā)植物體外觀形態(tài)改變.然而，大腸埃希菌O157：H7植物內生化與植物體損傷程度、植物免疫系統(tǒng)及其模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）、附生植物微生物群落和根際土壤微生物群落等因素之間存在復雜的交互作用.該文對大腸埃希菌O157：H7的污染來源、植物組織內生化途徑及其影響因素等進行了綜合的闡述，為深入了解人畜共患病原菌植物內生化機制和污染風險提供參考，以便降低人畜共患病原菌對人類健康和環(huán)境安全的危害.

大腸埃希菌O157：H7；植物；內生化

SummaryShiga toxin-producing Escherichia coli O157：H7，one of the most emergent foodborne pathogens，can cause illnesses ranging from diarrhea to hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome.Escherichia coli O157：H7 is spread into the environment via fecal shedding or field application of farm effluent.The produce can be contaminated by E.coli O157：H7 through soil，feces，irrigation water，manure application，insects，or postharvest washing.Fresh produces，especially leafy greens that be consumed raw，are increasingly being recognized as the foremost transmitting vehicles.Many studies have shown that E.coli O157：H7 can internalize within a variety of tissue types.Although the internalized E.coli O157：H7 makes no difference to the normal growth of plants，it brings risks when people take in the unpasteurized fresh food.In this review，sources of contamination，main routes of internalization，interactions between internalized E.coli O157：H7 and the plant host as well as other microbeswere stated.

The internalization of E.coli O157：H7 in fresh produce has been found to be associated with many routes including stomata，lenticels，sites of root emergence and sites of biological or physical damage.Because stomata are generally found in greater densities on the underside of leaves，greater internalization of E.coli O157：H7 on leaves would be likely on the abaxial side than on the adaxial side.Root uptake of E.coli O157：H7 and subsequent internalization has also been widely reported.Damaged leaves release more nutrients onto the leaf surface，which allow E.coli O157：H7 to grow and induce more E.coli O157：H7 to get into the leaves.Various factors including growth substrate，inoculums level，and plant species and cultivar，have shown to affect the level of internalization.

Although there is no obvious change on the appearance of the plant，complicated interactions between internalized E.coli O157：H7 and the plant hosts have been discovered.Plant hosts have some pattern recognition receptors（PRRs）to recognize pathogen associated molecular patterns（PAMPs），and further activate plant immune response to limit the growth and spread of the pathogen.PAMPs contain flagellin，peptidoglycan，lipopolysaccharide，and other components which derived from pathogens.Studies have showed that elimination of these PAMPs leads to better growth of E.coli O157：H7 in the plant.Furthermore，phytopathogen can grow in the plant through secreting effector proteins to disturb the recognition of PAMPs by PRRs.Whether human pathogen currently carries the effector proteins is yet to be determined.Further research is needed to explain the mechanism of E.coli O157：H7 invasion and growth in the plant hosts.In addition，interactions between E.coli O157：H7 and the epiphytic microbes would affect the internalization of E.coli O157：H7.The metabolic products of the epiphytic microbes and the competition of nutrients between E.coli O157：H7 and the epiphytic microbes could limit the growth of E.coli O157：H7.On the other hand，some epiphytic microbes could produce available carbon sources to help E.coli O157：H7 grow and get into the plant hosts.

In short，better understanding of the internalization of E.coli O157：H7 in plants and risks will be helpful in reducing the pathogenic infection to human.Further researches remain to be done in revealing the molecular and genetic details of the mechanisms that are involved to control the contamination of fresh produce by human pathogenic bacteria.

微生物引起的食源性疾病是我國頭號食品安全問題，亦受到世界上其他國家的極大關注［1］.其中，因畜禽糞便攜帶的人畜共患病原菌（如沙門菌、大腸埃希菌O157：H7等）污染農產品而引發(fā)的食源性疾病及危害，目前受到了人們的特別關注.研究表明，人感染10個大腸埃希菌O157：H7活菌即可致病，導致患者出現劇烈腹痛，引起出血性結腸炎甚至溶血性尿毒綜合征［2］.近年來，大腸埃希菌O157：H7在全球許多國家導致多起暴發(fā)流行，且引起的食源性疾病病死率較高，是國際公認的食源性致病菌之一.其暴發(fā)主要與食用大腸埃希菌O157：H7污染的水果和蔬菜有關，這些蔬菜涉及芽苗菜、菠菜、生菜、涼拌卷心菜、番茄、各種瓜類、蘋果汁、色拉等.大腸埃希菌O157：H7病原微生物可隨農用污水、污泥或畜禽糞便等有機廢棄物的添加進入土壤，并在土壤中存活，其存活時間可達數天乃至數百天［3-7］，并可附著于生鮮農產品表面或內生化植物體內造成污染［8-12］.

細菌植物內生化是指細菌通過植物表面自身通道（如氣孔、皮孔和側根發(fā)生處等）或表面損傷（生物損傷或物理損傷等）各種途徑進入到植物組織的細胞間和細胞內，隨植物的細胞分化而進入中柱并在植物體內繁殖，與植物構成共生關系但不形成特殊結構的一種現象［13-14］.植物病原菌進入植物體可使植物致病，受植物病原菌侵害的宿主植物在外觀上有別于正常植株［15］，而人畜共患病原菌進入植物體后植物無外觀表現，不易被察覺.研究發(fā)現，植物體可對內生化的大腸埃希菌O157：H7形成保護，表面殺菌劑難以將其消滅；大腸埃希菌O157：H7進入植物體內后，宿主植物體內的某些物質成分可作為病原菌生長所需的營養(yǎng)物質，但與此同時，宿主植物也會分泌一系列物質來抑制內生化病原菌的繁殖與擴散，營養(yǎng)物質與抑菌物質作用的差異則決定了病原菌的內生化程度及其生長狀況［10］.

由于大腸埃希菌O157：H7致病的嚴重性，其在生鮮農產品上內生化的情況亦引起了國內外研究者的重視.本文基于國內外近年來的研究進展，對大腸埃希菌O157：H7來源、植物內生化途徑及其影響因素等進行簡要綜述，為深入了解大腸埃希菌O157：H7植物內生化機制和污染風險提供參考.

1 植物體中大腸埃希菌O157：H7的來源

大腸埃希菌O157：H7可通過多種途徑附著于植物表面，但植物表面溫度波動頻繁、溫差大、濕度低、營養(yǎng)物質缺乏等因素都抑制了病原菌在植物體表的繁殖，這或許是迫使大腸埃希菌O157：H7進入植物體的誘因之一［16］.對于病原菌進入植物體內大致可歸為3種主要途徑：污水灌溉、糞肥施用和昆蟲傳播.

1.1 污水灌溉

大腸埃希菌O157：H7可在水中存活相當長的時間，采用受病原菌污染的農用水進行灌溉，病原菌可隨水流動，附著于植物體表面，當大腸埃希菌O157：H7隨水流動至植物體表通道或傷口時停留并伺機進入植物體內［17］.有實驗結果顯示，生菜種子播種前，將其浸泡于含有大腸埃希菌O157：H7的水中，經過42 h的育苗培養(yǎng)，在生菜幼苗根系表面和葉際表面均可檢測到大腸埃希菌O157：H7的存在［18］.此時，大腸埃希菌O157：H7雖未發(fā)生植物內生化，但病原菌在植物體表的停留卻大大增加了病原菌進入到植物體內的風險.Solomon等［19］用含有大腸埃希菌O157：H7的污水對生菜進行灌溉（污水不接觸生菜地上部分），5 d后可在植物體內檢測到病原菌的存在；而當灌溉污水與植物體地上部分直接接觸時，5 d后病原菌內生化發(fā)生的概率明顯升高［20］.將無病原菌污染的菠菜幼苗置于含有大腸埃希菌O157：H7的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，經過7 d培養(yǎng)后，可在莖中檢測到大腸埃希菌O157：H7的存在［21］.也有證據表明，生鮮農產品在收割后清洗，植物體表面的病原菌極易隨水流動并通過主莖進入植物體內［22］.

1.2 糞肥施用

畜禽糞便是優(yōu)質的有機肥料，但大腸埃希菌O157：H7等病原菌的檢出率較高，畜禽糞便作為肥料或土壤改良劑施用是大腸埃希菌O157：H7污染農產品的主要來源之一［2］.我國雖無大型的大腸埃希菌O157：H7爆發(fā)流行，但隨糞肥的添加，大腸埃希菌O157：H7也被帶入土壤，為病原菌進入植物體提供了途徑.與此同時，糞肥中營養(yǎng)物質更為豐富，使得土壤中大腸埃希菌O157：H7的存活時間更長［23］，平均持續(xù)時間可達56 d以上［24］.Ingham等［25］發(fā)現，在粉質黏壤土中添加未經堆肥處理的牛糞，大腸埃希菌O157：H7的存活時間可達90 d以上，是對照組的兩倍.Solomon等［19］的實驗結果也證明，施用含有大腸埃希菌O157：H7的糞肥后，可在生菜中檢測到病原菌的內生化，且大腸埃希菌O157：H7可在植物體內長距離移動，葉片中也檢出病原菌的存在.Looper等［26］用牛尾草做實驗，施用大腸埃希菌O157：H7污染的糞肥，4 d便可檢測到病原菌內生化的現象.

1.3 昆蟲傳播

引起農產品中大腸埃希菌O157：H7污染的來源還可能是一些昆蟲的媒介活動，其傳播范圍廣，且具有不定向性，從而增加了病原菌植物內生化的傳播途徑和范圍［27］.攜帶病原菌的昆蟲與植物體反復接觸以及植物體表面損傷共同作用，是導致蔬菜污染并引發(fā)食源性疾病的重要原因.Talley等［28］的研究結果表明，家蠅可以攜帶大腸埃希菌O157：H7，污染生長的菠菜和生菜.也有實驗表明，果蠅唇瓣環(huán)溝處是大腸埃希菌O157：H7的主要聚集處，其攜帶病原菌時間可長于7 d；將攜帶大腸埃希菌O157：H7的果蠅與蘋果接觸，15 h后可在蘋果內部檢測到大腸埃希菌O157：H7的存在；另外，雌性果蠅將產卵器插入植物表皮以下進行產卵時，可將大腸埃希菌O157：H7帶入蘋果中，增大了食用風險［29］.

2 大腸埃希菌O157：H7植物內生化途徑

細菌侵襲宿主細胞主要有2種機制［30］：一種是細菌配體與細胞相應受體結合后，細菌被宿主細胞膜包裹而攝入，被稱為“拉鏈（zipper）”機制；另一種是細菌依賴TTSS（typeⅢsecretion/translocation systems）系統(tǒng)將效應蛋白轉運至宿主細胞，并通過“觸發(fā)（trigger）”機制誘導細菌進入宿主細胞.這些效應蛋白可誘導細胞骨架重排，導致“巨吞飲”，促使細菌入侵.但眾多研究結果表明，病原菌無法利用這種機制進入植物體內，所以大多通過植物天然孔道和受損部位進入植物體內［31］.

氣孔作為葉片重要組成部分，其活動由其周邊的保衛(wèi)細胞調節(jié)，在生理上具有重要的意義，是植物碳同化、呼吸、蒸騰等代謝作用中空氣和水蒸氣的通路，同樣也是植物地上部分病原菌最易入侵的天然通道［32］.相關研究已證明，大腸埃希菌O157：H7可通過氣孔進入生菜和菠菜植株中［33-35］.Er i c k s on等［36］的研究發(fā)現，在噴霧灌溉條件下大腸埃希菌O157：H7在葉片背面聚集更多，數量顯著高于葉片正面；在光照條件下葉片正面水分更易揮發(fā)，溫度更高，不利于病原菌適應環(huán)境.而陸生植物葉片氣孔多數分布在葉片背面，這也就相應地為病原菌內生化提供了條件.

根系為植株提供物理支撐的同時，也是營養(yǎng)吸收的主要來源，是植株必不可少的結構.根系隨植株的生長不斷向土壤延伸，與土壤直接接觸并產生表面磨損，使得病原菌更易進入土壤根系.對比土壤栽種和營養(yǎng)液培養(yǎng)發(fā)現，植物在土壤中栽培時，大腸埃希菌O157：H7更易發(fā)生植物內生化現象［21］.通過顯微鏡觀察發(fā)現，大腸埃希菌O157：H7通過侵入擬南芥根系的側根發(fā)生處從而進入植物體［37］.亦有相關實驗證明，大腸埃希菌O157：H7可從污染土壤中進入植物根部，再從植物內部遷移至地上部分［19］.另外，在離根軸表面數毫米之內的根際微域土區(qū)，植物根系不斷地分泌各種代謝產物，為微生物的生命活動提供了源源不斷的營養(yǎng)源［38］.Ibekwe等［39］的實驗發(fā)現，在大腸埃希菌O157：H7污染的土壤中，根際土壤中的病原菌濃度顯著高于非根際土壤.

同樣，大腸埃希菌O157：H7也可通過表皮損傷進入植物體內，例如物理損傷和生物損傷.植物體表面損傷，甚至是肉眼不可見的損傷，也可為大腸埃希菌O157：H7的侵入和繁殖創(chuàng)造條件.有實驗表明，在人為割傷或黃桿菌造成生物損傷的葉片上澆灌含有大腸埃希菌O157：H7的水后，10 d內可持續(xù)檢測到植物體內大腸埃希菌O157：H7的存在［40］.也有研究者發(fā)現，割傷部位會分泌出傷流液，其中的一些成分會為病原菌的生長提供營養(yǎng)物質，傷口部位也為病原菌進入植物體內開辟了通道.如大腸埃希菌O157：H7易附著在生菜葉［41］、蘋果［42］的割傷部位繁殖.

3 大腸埃希菌O157：H7與宿主植物間的相互作用

大腸埃希菌O157：H7進入植物體后，宿主植物雖未表現出表觀的病變，但仍與病原菌在內部發(fā)生相互作用，而這些相互作用的程度決定了大腸埃希菌O157：H7植物內生化的程度.

3.1 植物先天免疫反應

在植物與病原菌協(xié)同進化過程中，也逐漸形成了一系列復雜高效的保護機制來抵御病原菌的侵染.宿主植物體內存在一系列植物模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）可識別病原菌鞭毛蛋白、肽聚糖、脂多糖等相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），以迅速觸發(fā)基礎免疫，包括超敏反應、活性氧爆發(fā)、植物抗毒素的產生以及一些抗病相關基因的表達.此類防御反應可以有效地抑制病原菌的生長和移動，控制病情［43-44］.大腸埃希菌O1 5 7：H7具有許多病原菌相關分子模式，可被宿主植物先天免疫系統(tǒng)識別；有相關實驗證明，消除這類病原菌相關分子模式可增加大腸埃希菌O157：H7植物內生化的數量［45］.

3.2 效應因子蛋白對植物先天免疫反應的抑制

研究發(fā)現，植物病原菌可分泌特殊的效應因子蛋白（effector proteins）進入植物的細胞質中與宿主蛋白發(fā)生作用，通過影響信號傳導來抑制植物模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）對病原菌的識別，從而降低植物對外來侵入病原體的免疫作用，使得病原體在植物體內大量積累［4647］.而人畜共患病原菌是否存在這種機制抑制宿主植物的免疫效應還有待更多實驗來證明.但通過基因分析發(fā)現，大腸埃希菌中多數與致病基因相關的編碼效應因子蛋白的基因與植物病原菌中的基因相似，即可能會存在不同物種間基因的水平轉移，且人畜共患病原菌可適應相當廣范圍的宿主植物內環(huán)境也可能與此有關［48］.值得一提的是，人畜共患病原菌或可分泌效應蛋白直接作用于宿主細胞，刺激宿主細胞合成糖轉運蛋白，分泌單糖到質外體空間，為病原菌的生長提供營養(yǎng)條件［49］.

3.3 效應因子蛋白觸發(fā)的免疫反應

宿主植物細胞可對病原菌分泌的效應因子蛋白進行檢測，這種效應觸發(fā)免疫力是宿主植物針對病原微生物效應因子蛋白進化出的反擊機制：通過直接或間接識別病原菌分泌的某些抗性效應因子蛋白，在侵染位點啟動快速劇烈的防御應答，來抑制病原菌植物內生化［44，50］.目前暫無相關實驗數據表明這種宿主植物對病原菌效應因子蛋白的識別作用在植物體與人畜共患病原菌間發(fā)生，但進一步的研究也可能會選育出抗人畜共患病原菌的作物品種.

4 大腸埃希菌O157：H7與其他微生物間的交互作用

4.1 附生植物微生物群落

大腸埃希菌O157：H7可進入植物體內，附生植物微生物的存在同樣影響著大腸埃希菌O157：H7植物內生化的程度和存活時間.人畜共患病原菌若要在植物表面或植物體內寄居，必須與存在于植物表面或內部的微生物群落進行競爭.植物體的附生微生物和外來入侵的病原菌之間存在著對生存空間和營養(yǎng)物質的爭奪，且附生微生物的代謝產物可抑制病原菌的內生化與生長［16，51］.如Lopez-Velasco等［52］的研究發(fā)現，歐文菌對大腸埃希菌O157：H7生長的抑制不僅表現在對碳源的爭奪上，其代謝產物也可顯著抑制大腸埃希菌的生長速率.

與此相反，附生植物微生物對大腸埃希菌O157：H7植物內生化亦有促進作用.存在于植物體內的其他細菌或真菌具有分解細胞壁上聚合物的能力，大腸埃希菌O157：H7或可利用這些被分解后的小分子物質完成自己的營養(yǎng)攝取［51］.同時，植物病原菌會對植物體表面造成損傷，以傷口為中心的微環(huán)境恰好為大腸埃希菌O157：H7的繁殖提供了條件.另有研究發(fā)現，大腸埃希菌O157：H7的植物內生化有時是與其他一種或多種腸桿菌屬或假單胞菌屬的細菌共同侵入的結果，與附生微生物的共同侵入提高了病原菌侵入后的生長水平［50，53］.

4.2 根際土壤微生物群落

根際環(huán)境土壤p H值、氧化還原電位、養(yǎng)分濃度和微生物活性的變化等均與土體土壤有明顯差異，根系分泌物則決定了根際微生物的種類和活性［38］.根際微生物群落對病原菌植物內生化影響較為復雜和多變，目前研究還較少.已發(fā)現的抑制大腸埃希菌O157：H7生長的細菌有假單胞菌、歐文菌、不動桿菌、微小桿菌和芽孢桿菌等［36］.植物病原菌侵染根部可破壞細胞膜透性，使細胞內化合物以擴散方式釋放至根際［54］.從營養(yǎng)物質獲取層面上而言，這有益于大腸埃希菌O157：H7的營養(yǎng)物質獲取.最新研究發(fā)現，土壤中大腸埃希菌O157：H7的存活時間與微生物生物量碳和土壤氮含量間呈顯著正相關，而與土壤綠彎菌的豐度呈顯著負相關［5］.病原菌侵染根部將導致根的分泌作用加強，根際周圍微生物種群數量增加，使得病原菌與根際微生物群落間的交互作用更為復雜［55］.因此，更多的有關根系分泌物、土著微生物種類、土壤類型等因素對病原菌存活及進入植物體的影響有待進一步研究.

5 前景與展望

目前，無論是病原菌植物內生化路徑跟蹤監(jiān)測水平，還是人們對內生菌遺傳特性及內生菌與宿主之間關系的了解來看，內生菌相關研究都處于初級階段.特別是內生菌與宿主關系方面，有許多值得深入探討的地方.比如內生菌增強宿主生存的適應性的相關機制，內生菌與宿主交互過程等，均需要進一步研究.大腸埃希菌O157：H7植物內生化程度受土壤種類、病原菌濃度、植株種類和品種、植株生長水平等多種因素影響，近年來逐漸引起公眾的注意.更細致化地了解其內生化機制將有助于對大腸埃希菌O157：H7植物內生化的控制，從而減少人類食用生鮮農產品的風險，更加有效地預防大腸埃希菌O157：H7給人類造成的危害.

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Yang Li?，Wang Haizhen?*，Yao Zhiyuan，Wu Jianjun(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Subtropical Soil and Plant Nutrition,Institute of Soil and Water Resource and Environmental Science,College of Environment &Resource Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Escherichia coli O157：H7；plant；internalization

X 171；R 378.2

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2014.07.212

國家自然科學基金資助項目（40971255）.

汪海珍，Tel：+86 571 88982063；E-mail：mywhz@163.com

聯(lián)系方式：楊黎，E-mail：chengche0808@163.com；汪海珍，E-mail：mywhz@163.com.?為共同第一作者

2014 07 21；接受日期（Accepted）：2014 10 31；

日期（Published online）：2015 01 19 URL：http：//www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20150119.1659.008.html