左小淑 陸宇

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·綜述·

氯苯吩嗪抗結(jié)核作用的研究進(jìn)展

左小淑 陸宇

氯苯吩嗪是一種吩嗪類衍生物，具有抗微生物活性，最初被用來治療麻風(fēng)病。近年來發(fā)現(xiàn)其具有很強的體內(nèi)外抗結(jié)核活性，尤其是其對多耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株具有殺菌活性，相關(guān)研究也證實了該藥對治療多耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病具有很好的前景，其抗結(jié)核作用新靶點和作用機制的研究是近年的熱點。本研究旨在介紹氯苯吩嗪抗結(jié)核作用的藥理學(xué)特性及其臨床應(yīng)用情況，并重點闡述其抗結(jié)核作用機制的研究進(jìn)展。

分枝桿菌, 結(jié)核； 抗結(jié)核藥； 氯苯吩嗪

結(jié)核病是威脅人類健康的重要傳染病，據(jù)估算，2012年全世界共有860萬例結(jié)核病患者，130萬例死于結(jié)核病[1]。隨著耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)患者的不斷增加，給結(jié)核病的控制帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。WHO預(yù)計2010—2015年間全球27個耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家將會出現(xiàn)130萬例以上的MDR-TB患者[2]，同時Mtb和HIV雙重感染患者逐年增多[3]，亟需開發(fā)新的針對耐藥Mtb有效的新的抗結(jié)核藥物。

新藥研發(fā)周期長，難度大，對現(xiàn)有藥物的再評價、再利用是一個捷徑。1954年，Barry等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)氯苯吩嗪具有抗結(jié)核活性；同時，Reddy 等[5]及Jagannath等[6]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其對耐藥Mtb的最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration, MIC)為 0.12～2.0 μg/ml 之間，顯示其具有較好的活性。WHO在 2008 年發(fā)布的《耐藥結(jié)核病指南》中將氯苯吩嗪作為治療耐藥結(jié)核病的第5組藥物，在1～4組藥物無法組成合理方案時可考慮使用。筆者從藥效學(xué)、作用機制、藥代動力學(xué)、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)等4個方面介紹氯苯吩嗪在抗結(jié)核作用方面的最新研究進(jìn)展。

氯苯吩嗪的作用機制

氯苯吩嗪[10-(對-氯苯基)-2,10-二氫-3-(對-氯苯氨基)-2-異丙亞氨基吩嗪]，亦稱氯法齊明、克風(fēng)敏、亞胺基苯嗪、B663，英文名clofazimine (CFM)；分子式 C27H22Cl2N4，相對分子質(zhì)量473.40，熔點 210 ℃～212 ℃。它是在 N2、N3、N7有替代物的一類吩嗪，是一種紅色的亞胺基苯嗪類藥物，氯苯吩嗪最早由 Barry[4]和他的同事們發(fā)現(xiàn)的，是具有高活性的抗結(jié)核藥物[7]，并由愛爾蘭化學(xué)研究委員會在 1944年分析合成，將其作為治療結(jié)核病的藥物。

氯苯吩嗪抗菌機理尚不完全清楚，過去的研究表明主要包括破壞DNA、增加中性粒細(xì)胞磷脂酶A2(PLA2)的活性，導(dǎo)致溶血磷脂的增加或釋放、抑制DNA依賴的RNA聚合酶，干擾菌體蛋白質(zhì)合成[8-10]，從而達(dá)到抑制Mtb生長的作用。

但近年來隨著研究的深入，研究重點逐漸轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞外膜[10-16]，而細(xì)胞外膜上的細(xì)胞膜氧化還原呼吸鏈和離子轉(zhuǎn)運體則被認(rèn)為是作用的主要靶點。

一、關(guān)于氧化還原呼吸鏈

早在1957年，Barry等[4]就率先提出了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原循環(huán)可能是一種抗菌機制，由于氯苯吩嗪具有高度親脂性和氧化還原電位，它通過氧化還原反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)生成大量具有抗菌活性的活性氧(ROS)，主要為超氧化物和過氧化氫(H2O2)，從而起到抗菌作用。但在1992年，Van Rensburg 等[16]公布了另外一種與Barry等相悖的實驗結(jié)果，他們用對氯苯吩嗪敏感的革蘭陽性細(xì)菌進(jìn)行了大規(guī)模的實驗，觀察到有無過氧化氫酶與對氯苯吩嗪是否敏感并無確切聯(lián)系。然而，至2011年，Yano 等[17]再次恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原循環(huán)作為氯苯吩嗪抗微生物活性的一種機制的概念。他們的研究：將MIC濃度的氯苯吩嗪加入含有終端細(xì)胞色素呼吸鏈抑制劑氰化鉀(KCN)和氧化輔因子(NADH)的恥垢分枝桿菌分離膜成分中，會導(dǎo)致NADH發(fā)生序列氧化反應(yīng)、氯苯吩嗪發(fā)生還原和氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生大量超氧化物和過氧化氫。若將上述膜成分更換為重組Ⅱ型NADH脫氫酶(NDH-2)(來自Mtb，為初始氧化呼吸鏈NADH：醌氧化還原酶，在呼吸鏈早期起作用且對KCN不敏感)，也同樣有效促進(jìn)了ROS形成。作者就此提出假設(shè)：氯苯吩嗪與NDH-2的底物(甲基萘醌類)競爭由NADH傳遞的電子，在Mtb呼吸鏈的一開始就還原氯苯吩嗪，隨后還原態(tài)的氯苯吩嗪被分子氧氧化，進(jìn)而產(chǎn)生大量超氧化物和過氧化氫。并從以上假設(shè)中進(jìn)一步推導(dǎo)出NDH-2可能是氯苯吩嗪的作用靶點，即氯苯吩嗪通過抑制氧化呼吸鏈，干擾電子傳遞過程，產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物，干擾能量代謝，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

二、關(guān)于膜的不穩(wěn)定和功能障礙

Van Rensburg等[16]首先報道了氯苯吩嗪對包括Mtb在內(nèi)的革蘭陽性細(xì)菌有抗菌活性，并提出了氯苯吩嗪是通過破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能而產(chǎn)生抗菌活性的機制假說。具體體現(xiàn)在以下幾點：首先，將包括Mtb在內(nèi)的革蘭陽性細(xì)菌暴露于MIC濃度的氯苯吩嗪中，能檢測到溶血磷脂積累。其次，可以在低微摩爾濃度的溶血磷脂中模擬出氯苯吩嗪對包括Mtb在內(nèi)的革蘭陽性細(xì)菌的抑制作用。再次，將Mtb暴露于MIC濃度的氯苯吩嗪或溶血磷脂中數(shù)分鐘，幾乎可以完全抑制細(xì)胞膜對鉀離子(K+)的攝取，這是膜穩(wěn)定性遭到破壞的最早指標(biāo)，細(xì)胞膜功能障礙導(dǎo)致微生物ATP水平降低，從而干擾細(xì)胞的膜電位水平，進(jìn)而干擾微生物能量代謝，最終導(dǎo)致微生物死亡[18-20]。還證實了若用生育酚(AT，具有良好的抗氧化活性和膜穩(wěn)定特性)預(yù)處理微生物后，氯苯吩嗪和溶血磷脂對微生物抑制作用明顯衰減[21]。

總之，細(xì)胞內(nèi)氧化還原循環(huán)和膜破壞是氯苯吩嗪介導(dǎo)的抗菌活性的2個主要機制。

氯苯吩嗪的作用機制還未完全闡明，部分原因是由于低頻耐藥菌株[7]的產(chǎn)生；另外，在對氯苯吩嗪細(xì)胞內(nèi)的抗菌活性研究中，發(fā)現(xiàn)相互作用可能會加強巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗菌活性，宿主和抗菌性能的結(jié)合可能會抑制暴露于氯苯吩嗪的細(xì)胞內(nèi)Mtb的生長[22]，進(jìn)一步造成了研究的復(fù)雜性。

氯苯吩嗪的藥效學(xué)

氯苯吩嗪是抗結(jié)核活性較高的吩嗪類化合物，對多種敏感和耐藥的分枝桿菌均有活性，包括麻風(fēng)分枝桿菌、Mtb及鳥-胞內(nèi)分枝桿菌等[7]。

一、體外抗結(jié)核活性

Reddy等[5]和Jagannath等[6]研究證實，氯苯吩嗪具有良好的體外、細(xì)胞內(nèi)及體內(nèi)抗結(jié)核活性。作者研究發(fā)現(xiàn)，氯苯吩嗪對Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)的MIC為0.12 μg/ml，所入選的20株菌株(包括16株耐藥株)對氯苯吩嗪的MIC位于0.06～2.0 μg/ml 之間，對氯苯吩嗪的MIC 90和MIC 50分別為≤1.0 μg/ml和≤0.12 μg/ml，說明氯苯吩嗪不僅對敏感株具有很強的抗結(jié)核活性，且對耐利福平、乙胺丁醇和多藥耐藥的Mtb同樣有抗結(jié)核活性。Cho等[23]已經(jīng)通過建立體外LORA(low-oxygen-recovery assay)模型，評估了氯苯吩嗪對非復(fù)制TB的作用。陸宇等[24]研究證實氯苯吩嗪與PAS、丙硫異煙胺、克拉霉素和卷曲霉素聯(lián)合用藥，其MIC分別降至1/4～1/8，分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)均<0.5，表明氯苯吩嗪與上述4種抗結(jié)核藥物間具有協(xié)同作用。

二、體內(nèi)抗結(jié)核活性

Adams等[25]已經(jīng)證實了氯苯吩嗪在小鼠急性和慢性模型中均具有良好的殺菌活性。近期，Xu等[8]通過構(gòu)建LORA模型及慢性感染Mtb的小鼠模型，證實了氯苯吩嗪不僅在體外對Mtb持留菌或潛伏感染有抗結(jié)核活性，而且對長期低氧條件下的體內(nèi)非復(fù)制持留Mtb也具有很好的活性；Grant等[9]也有類似報道。近期最新研究發(fā)現(xiàn)，氯苯吩嗪對Mtb感染小鼠的療效與其病理改變程度相關(guān)，Irwin等[10]用兩種小鼠模型(BALB/c mice & C3HeB/FeJ)來評價氯苯吩嗪單獨用藥的療效，發(fā)現(xiàn)氯苯吩嗪在BALB/c 傳統(tǒng)小鼠模型中活性很強，但在C3HeB/FeJ小鼠模型上其活性就減弱了，原因在于該藥對C3HeB/FeJ鼠的療效與肉芽腫形成的病理階段相關(guān)(與人類相似)，對具有干酪樣壞死肉芽腫改變的C3HeB/FeJ小鼠其治療活性明顯減弱。陸宇等[24]通過小鼠結(jié)核模型證實了氯苯吩嗪與克拉霉素聯(lián)合應(yīng)用較單獨應(yīng)用的抗結(jié)核作用明顯增強，表明二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。近期，Tasneen等[12]也證實了氯苯吩嗪與吡嗪酰胺及Bedaquiline聯(lián)合應(yīng)用的療效優(yōu)于現(xiàn)有的一線抗結(jié)核方案。氯苯吩嗪聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的二線藥物治療方案與不包含氯苯吩嗪的方案相比，顯著改善了小鼠的肺組織培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率及預(yù)防復(fù)發(fā)[13]。另外，吡嗪酰胺和Bedaquiline在加入氯苯吩嗪后其抗結(jié)核活性顯著提高[14]。

氯苯吩嗪的藥代動力學(xué)

一、吸收

氯苯吩嗪在不同的種屬之間吸收不同，鼠類和猴子吸收較好，兔子和豚鼠等吸收較差。在不同的個體其吸收也是有差異的[26]。由于該藥物脂溶性強，具有極強的疏水性，故通過注射途徑給藥吸收很慢。所以，目前多通過口服途徑給藥。另外，氯苯吩嗪的吸收程度還與進(jìn)食與否及高脂肪飲食有關(guān)[13，27-28]。Adams等[25]通過實驗證實了氯苯吩嗪的脂質(zhì)體膠囊制劑可以明顯提高氯苯吩嗪的耐受濃度，故目前臨床應(yīng)用的多為氯苯吩嗪軟膠囊，50 mg/粒，推薦劑量是100 mg/d。Desikan和Balakrishnan[29]已經(jīng)研發(fā)出氯苯吩嗪的納米制劑，該懸液在提高了氯苯吩嗪的溶解度的同時還降低了其不良反應(yīng)。

二、分布

口服給藥后，氯苯吩嗪的血漿濃度很低，主要聚集在巨噬細(xì)胞和脂肪組織中[26,29-30]。氯苯吩嗪在脾臟、肝臟、肺臟、脂肪組織中的濃度較高，在身體的其他部分亦有分布，如骨骼、肌肉、皮膚、心臟、眼睛、膽囊和神經(jīng)組織，但相對濃度較低。還存在于泌尿、膽汁、汗液、乳汁、眼淚、唾液中。氯苯吩嗪能夠小量穿過血腦屏障[30-31]，也能通過胎盤[32-34]。氯苯吩嗪與其他抗結(jié)核藥物間存在著相互作用。印度學(xué)者Venkatesan 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，同時應(yīng)用異煙肼和氯苯吩嗪，可提高氯苯吩嗪的組織濃度，并能同時降低脂肪組織的濃度。Horita 等[36]在研究抗結(jié)核藥物間的相互作用時發(fā)現(xiàn)，氯苯吩嗪在高于0.25 μmol/L的濃度時具有輕度誘導(dǎo)終末分化肝細(xì)胞(HepaRG細(xì)胞)細(xì)胞色素P450(CYP3A4)酶的活性，提示氯苯吩嗪能自發(fā)誘導(dǎo)人類肝臟細(xì)胞中的CYP3A4活性。

三、代謝-排泄

由于氯苯吩嗪主要以結(jié)晶形式存在(高達(dá)99%)，故其半衰期很長。一室模型證明短期低劑量的消除半衰期需要1周；用長期和(或)高劑量的治療，消除半衰期需要 70 d或更久。氯苯吩嗪主要通過糞便排泄，少量可通過皮脂、汗液、尿液、痰液和乳汁排泄[37]。

氯苯吩嗪的臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)

一、臨床應(yīng)用

氯苯吩嗪用于治療結(jié)核病歷經(jīng)2次高峰。第一次是在20世紀(jì)60年代初，即最初發(fā)現(xiàn)其具有抗結(jié)核作用時，但由于該藥應(yīng)用于臨床后效果并不滿意，且當(dāng)時大量的一線抗結(jié)核藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，且效果很好，于是氯苯吩嗪便被冷落了下來。第二次是在20世紀(jì)90 年代初，隨著復(fù)治結(jié)核病中耐藥患者的逐漸增多，由于主要的一線抗結(jié)核藥物(異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等)大多耐藥，二線抗結(jié)核藥物(乙硫或丙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸、卡那霉素、卷曲霉素等)藥物不良反應(yīng)比較大，于是氯苯吩嗪再次受到重視, 主要用于治療臨床上耐藥結(jié)核病患者[38]。

Mukherjee等[39]證實了氯苯吩嗪在結(jié)核病感染尤其是MDR-TB患者治療中具有突出的優(yōu)越性。氯苯吩嗪不僅對治療多藥耐藥結(jié)核病有效，Gangadharam等[34]還提出了氯苯吩嗪對鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC)也具有活性，Hawkins等[40]還報道了氯苯吩嗪同時具有抗MAC感染合并 HIV感染的作用。

但目前關(guān)于氯苯吩嗪的臨床應(yīng)用，都是小樣本的零星報道，而且多是合并于多藥聯(lián)合用藥方案中。印度的一個研究曾用“Am+Ofx+CFM+甲硝唑”聯(lián)合治療MDR-TB，結(jié)果痰液陰轉(zhuǎn)率達(dá)60%，而對照組痰液陰轉(zhuǎn)率僅為43%[26]。Grosset等[13]提出在治療MDR-TB患者的眾多治療方案中，包含氯苯吩嗪的二線藥物治療方案與不包含該藥的治療方案相比，結(jié)果差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。Van Deun等[38]提出對于治療MDR-TB患者，氯苯吩嗪具有縮短療程、高效、價格低廉等優(yōu)勢，故在一些氯苯吩嗪容易獲得的國家,該藥已經(jīng)被包含在Mtb的標(biāo)準(zhǔn)治療方案中[35]。但由于該藥使用指征的限制(適應(yīng)證局限于麻風(fēng)病)，造成其獲取困難，從而限制了該藥的推廣使用。Xu等[41]在一項包含氯苯吩嗪治療方案的隊列研究中證明了氯苯吩嗪具有43.5%的可觀療效。在最近的一份納入3489例跨越10個國家的DR-TB患者的系統(tǒng)性綜述和Meta分析中，Dey等[42]報道了包含氯苯吩嗪方案高達(dá)62%的治愈率。

Gopal等[43]在一篇對氯苯吩嗪治療方案的綜述中，總結(jié)了自2012年為止的9個觀察性研究的結(jié)果，納入了599例服用氯苯吩嗪治療的DR-TB患者，其有效治愈率達(dá)65%，并且該數(shù)據(jù)不會因分層分析(即將DR-TB分為MDR-TB和XDR-TB)而改變。

二、不良反應(yīng)

氯苯吩嗪的不良反應(yīng)通常較輕微，與劑量相關(guān)，主要影響皮膚、眼結(jié)膜和消化道，停藥后可以恢復(fù)[28-29,44-45]。常見的不良反應(yīng)是皮膚色素沉著，呈現(xiàn)橘紅色的皮膚色素沉著，這種著色主要在軀干和面部，還有結(jié)膜、汗液、痰、尿、糞便和內(nèi)臟器官等[29]。除了皮膚外，該藥物還積聚于皮下脂肪、腎上腺、心臟、肝臟、肺、胰腺、腎臟、脾、骨髓和空腸黏膜固有層。另外，氯苯吩嗪可造成胃腸功能紊亂，其主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐和胃腸道不適。盡管它積聚于大多數(shù)器官，該藥物似乎極少產(chǎn)生致命毒性。該藥物無明顯的致畸作用，目前為止也無骨髓抑制的報道[45]。

結(jié)語與展望

綜上所述，氯苯吩嗪的抗結(jié)核活性已經(jīng)得到證實，氯苯吩嗪對體外、細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)的敏感株及MDR菌株均有效，且對MAC、合并HIV感染、體內(nèi)的非復(fù)制持留菌也有良好的抗結(jié)核作用。目前的多數(shù)研究集中在包含氯苯吩嗪的聯(lián)合用藥治療多藥耐藥結(jié)核病方面，未來可能需要更大樣本量的臨床研究來進(jìn)一步證實。

其作用機制還需要進(jìn)一步研究和闡明，可以利用基因芯片、蛋白表達(dá)譜等新的技術(shù)手段，還可以借鑒吩嗪類類似藥物的作用機制研究方法，來逐步揭示該藥物的作用機理。

氯苯吩嗪在臨床應(yīng)用方面具有較好的前景，仍需要專門為氯苯吩嗪而設(shè)計的大規(guī)模雙盲對照的臨床試驗來加以進(jìn)一步證實。氯苯吩嗪嗜脂肪組織性及半衰期長，導(dǎo)致皮膚色素沉著的不良反應(yīng)持續(xù)時間很長，一定程度上限制其臨床廣泛應(yīng)用。

目前相關(guān)研究通過改變劑型及給藥方式，以期在提高生物利用度的同時也能縮短其半衰期，從而減輕皮膚色素沉著的不良反應(yīng)。同時，近年來，全球結(jié)核病藥物研發(fā)聯(lián)盟(Global Alliance for TB Drug Development)聯(lián)合一些學(xué)術(shù)研究機構(gòu)，以吩噻嗪類藥物為基礎(chǔ)，成功篩選出一些吩嗪類優(yōu)勢化合物；Lu等[2]描述了12個類似物，所有12個化合物的體外抗菌活性都比氯苯吩嗪強，而且大多數(shù)化合物對低氧誘導(dǎo)的非復(fù)制Mtb也是有效的，目前這些類似物正在進(jìn)行體外抗菌活性驗證和動物實驗。在Mtb耐藥情勢嚴(yán)峻的情況下，開發(fā)研究氯苯吩嗪同類的優(yōu)勢化合物，保留抗結(jié)核活性的同時減少不良反應(yīng)，顯得迫切而又非常有意義。

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(本文編輯：薛愛華)

Advance in anti-tuberculous activity of clofazimine

ZUO Xiao-shu, LU Yu.

Department of Pharmacology, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute, Beijing 101149, China

Corresponding author: LU Yu, Email: luyu4876@hotmail.com

Clofazimine, a phenazine derivative possessing antimicrobial activity, was originally used to cure leprosy. Recently it has been found that clofazimine has potency against Mycobacterium tuberculosis, especially for multidrug-resistant strains. Related studies showed clofazimine has good potency in the treatment of multidrug and extensively multidrug-resistant tuberculosis. Thereby, study on the new targets and mechanisms of clofazimine have become the research hotspot in recent years. This review aims to introduce the latest advancement of clofazimine in terms of pharmacological properties and clinical applications, focusing on the mechanisms of anti-tuberculous action.

Mycobacterium tuberculosis； Antitubercular agents； Clofazimine

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.017

101149 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

陸宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2014-10-09)