許同龍 施忠民

（上海市第六人民醫(yī)院骨科，上海200233）

軟骨修復(fù)重建中細(xì)胞載體的研究進(jìn)展*

許同龍 施忠民**

（上海市第六人民醫(yī)院骨科，上海200233）

細(xì)胞載體（cellscaffold）是一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，即以特定的材料作為載體，將合適的種子細(xì)胞種植于載體上，使其能夠附著于載體上緩慢生長(zhǎng)的一種技術(shù)。在軟骨損傷后的修復(fù)重建工程中，細(xì)胞載體技術(shù)正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

在軟骨修復(fù)重建的組織工程中，細(xì)胞必須種植在一個(gè)可以維持三維結(jié)構(gòu)并能提供軟骨中細(xì)胞隨著時(shí)間的發(fā)展所需要的不斷變化的機(jī)械支持的環(huán)境中。因此，所選擇的細(xì)胞載體必須滿足以下條件：載體材料可生物降解、無(wú)細(xì)胞毒性、有合適的機(jī)械性能（與正常軟骨細(xì)胞基質(zhì)相似）和能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)性；同時(shí)載體必須有適當(dāng)?shù)谋砻婊瘜W(xué)，有能力被塑造成各種不同的大小和形狀。目前，應(yīng)用于軟骨修復(fù)組織工程的細(xì)胞載體材料主要分為以下四種：基于蛋白質(zhì)的聚合物、基于碳水化合物的聚合物、合成的聚合物、聚合物的復(fù)合材料。本文將對(duì)細(xì)胞載體的研究進(jìn)展作一綜述。

1 軟骨損傷修復(fù)的治療現(xiàn)狀

目前，對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)并沒(méi)有公認(rèn)的效果明確的治療方法。主流的治療方案主要分為三大類(lèi)，即保守治療、手術(shù)治療和經(jīng)細(xì)胞載體種植軟骨細(xì)胞的治療。

1.1 保守治療

其方法主要包括常規(guī)的物理治療、藥物治療、關(guān)節(jié)內(nèi)激素和潤(rùn)滑劑注射等。雖然治療方法對(duì)于大多數(shù)的軟骨損傷患者有一定療效，能夠在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但是在本質(zhì)上仍然改變不了軟骨損傷的情況。

1.2 手術(shù)治療

主要包括微骨折治療和移植治療。微骨折即對(duì)軟骨損傷區(qū)域作鉆孔處理，使得骨髓腔中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠隨著出血而達(dá)到損傷區(qū)域[1]，當(dāng)血液在損傷區(qū)域凝固后，凝血塊中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化形成修復(fù)組織，促進(jìn)損傷區(qū)域軟骨修復(fù)。移植治療即將骨膜、軟骨膜、自體軟骨組織或異體軟骨組織等移植于軟骨損傷區(qū)域，從而促進(jìn)局部軟骨修復(fù)。

1.3 經(jīng)細(xì)胞載體種植軟骨細(xì)胞

即通過(guò)多種方式將事先在體外制備種植有種子細(xì)胞的各類(lèi)細(xì)胞載體植入于軟骨損傷區(qū)域[2-6]。傳統(tǒng)的方法主要為事先在體外制備種植有種子細(xì)胞的各類(lèi)細(xì)胞載體膜，然后通過(guò)手術(shù)的方式將其植入到病變部位，在植入的同時(shí)常同時(shí)可清理剝脫病變軟骨，并根據(jù)病變部位的具體情況修整細(xì)胞載體膜，甚至對(duì)于較大的或非包容性的缺損可通過(guò)縫線加強(qiáng)固定。而現(xiàn)在較新的方法則可選擇注射治療，即將可生物降解的藻酸鈣凝膠作為載體材料與種子細(xì)胞復(fù)合后注射入需要修復(fù)的部位，并且凝膠注射進(jìn)入缺損之中后可以較好地充填缺損部位。其黏附性能也有利于局部的穩(wěn)定和組織缺損的修復(fù)，并且方便于臨床應(yīng)用，具有較好的應(yīng)用前景。Dahlin等[7]在一個(gè)兔子的軟骨損傷修復(fù)模型中，將軟骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)于細(xì)胞載體上后，將其置入兔子的軟骨損傷區(qū)域，12周后取得良好療效，且與其他對(duì)照組的治療結(jié)果對(duì)比后，具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2 軟骨修復(fù)重建中細(xì)胞載體的性質(zhì)

在軟骨修復(fù)重建的組織工程中，細(xì)胞載體的主要作用是為種植的細(xì)胞提供一個(gè)可以維持其隨時(shí)間變化的三維結(jié)構(gòu)的機(jī)械支持環(huán)境。因此，所選用的細(xì)胞載體必須具有以下的性質(zhì)：①可生物降解性[8]，即載體可在體內(nèi)被降解，且降解速度應(yīng)與新生組織的形成速度相匹配。②生物相容性，即載體對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，不會(huì)引發(fā)炎癥或免疫反應(yīng)。③細(xì)胞親和性，即載體表面理化性質(zhì)須有利于細(xì)胞的黏附和增殖，并能誘導(dǎo)細(xì)胞按預(yù)制形態(tài)生長(zhǎng)。④合適的力學(xué)性能和形狀，即載體材料須具有一定的可塑性和機(jī)械強(qiáng)度[9]，能夠形成穩(wěn)定的、有利于細(xì)胞生長(zhǎng)及接收養(yǎng)份的三維空間。⑤可調(diào)節(jié)性，可以通過(guò)合理的

手段，改變細(xì)胞載體的理化性質(zhì)和生物性質(zhì)，以適應(yīng)不同的細(xì)胞生長(zhǎng)需求，如可以被制作成合適的形狀，可以添加吸附不同的生物因子，以調(diào)控其中的種子細(xì)胞的生長(zhǎng)等[10]。

目前所掌握的這些細(xì)胞載體材料，在生物相容性、可降解性、細(xì)胞親和性、內(nèi)部微結(jié)構(gòu)、代謝微環(huán)境、機(jī)械強(qiáng)度及塑形靈活性等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)，迄今還沒(méi)有一種生物材料能完全符合組織工程軟骨組織構(gòu)建與應(yīng)用的要求。一般來(lái)說(shuō)，材料生物相容性、細(xì)胞親和性好，通常力學(xué)性能就會(huì)相對(duì)較差，且材料吸收速度過(guò)快[10]。合成的載體材料可批量生產(chǎn)，形態(tài)結(jié)構(gòu)可控性強(qiáng)、力學(xué)性能穩(wěn)定，但生物相容性、細(xì)胞親和性差，從而其黏附細(xì)胞能力較弱。另外，一些合成材料的降解產(chǎn)物可能引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)[10]。目前應(yīng)用最為廣泛的合成載體材料是聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物。但這些材料降解后代謝產(chǎn)物為酸性，會(huì)降低局部的pH值，從而影響軟骨細(xì)胞活性。聚乳酸多聚體植入體內(nèi)還易引起無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，甚至誘發(fā)癌變。Hendriks等通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)合成材料在促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和成熟方面均不如天然材料[11]。但現(xiàn)在越來(lái)越多的研究表明，單一的支架材料無(wú)法完全滿足軟骨修復(fù)的要求。因此，根據(jù)不同材料的生物學(xué)及力學(xué)性能，設(shè)計(jì)出天然材料與合成材料混合制成的細(xì)胞載體，是今后的主要研究方向。

3 軟骨修復(fù)重建中細(xì)胞載體的材料

3.1 基于蛋白質(zhì)的聚合物

目前階段，用于生物工程細(xì)胞載體的蛋白質(zhì)聚合物的例子有纖維蛋白、明膠、膠原蛋白等。纖維蛋白，是一種由纖維蛋白原轉(zhuǎn)化的蛋白，它是血凝塊的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。明膠，是由變性的膠原蛋白形成，可與生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、肽等結(jié)合，并且允許細(xì)胞粘連。膠原蛋白是生物細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成分，它用做細(xì)胞載體材料時(shí)，可以保留細(xì)胞的各種表型[12,13]。

NeoCart（Histogenics），由Ⅰ型膠原細(xì)胞載體與種植的自體軟骨細(xì)胞組成，它們一同被植入到了21例Ⅲ級(jí)軟骨缺損患者的股骨中[14]。將這些患者與隨機(jī)的9例接受關(guān)節(jié)鏡治療的同一類(lèi)型患者比較。在2年的隨訪中，相比接受關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者，細(xì)胞載體治療組的疼痛評(píng)分相較術(shù)前明顯降低（P＜0.05），并且在功能的改進(jìn)上和活動(dòng)度的增加上，也較微創(chuàng)手術(shù)更好。Ren等[15]最近的研究顯示一種由可注射的糖聚肽水凝膠制成的仿生物載體具有良好的機(jī)械性能和生物相容性。將兔子的軟骨細(xì)胞種植于該載體后，通過(guò)3周的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增值速度明顯優(yōu)于其他載體，同時(shí)其GAG和Ⅱ型膠原蛋白的產(chǎn)生也明顯較多。Hoyer等[16]的研究表明，由海蜇膠原蛋白制成的細(xì)胞載體的開(kāi)孔率可達(dá)98.2%，同時(shí)其還具有良好的機(jī)械性能和細(xì)胞低毒性。

3.2 基于碳水化合物的聚合物

諸如透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖和聚乙二醇等碳水化合物[17]，也可以以水凝膠的形勢(shì)，用在組織工程細(xì)胞載體中。這些細(xì)胞載體是由交叉聯(lián)合的碳水化合物聚合物，吸收大量的水構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)與正常人體軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的性質(zhì)相似。他們?cè)诩?xì)胞的封裝中也有效，可以使細(xì)胞在細(xì)胞載體中保持球形形態(tài)[18]。水凝膠細(xì)胞載體[19,20]可以通過(guò)改變他們的凝膠化的機(jī)制的方式，改變細(xì)胞載體的性質(zhì)，以及通過(guò)改變合成材料的夾雜物改變細(xì)胞載體的性質(zhì)，并通過(guò)添加生長(zhǎng)因子增強(qiáng)軟骨的形成。

研究發(fā)現(xiàn)，使用基于透明質(zhì)酸的細(xì)胞載體hyalograftC移植術(shù)治療的患者，在2年的隨訪調(diào)查中，功能評(píng)分有持續(xù)性的改進(jìn)（Anika療法）。在7年的隨訪調(diào)查中，對(duì)62例采用平均大小2.5 cm2的透明質(zhì)酸的細(xì)胞載體hyalograftC治療的患者進(jìn)行了包括臨床和影像學(xué)在內(nèi)的功能評(píng)估和疼痛評(píng)估[21]。采用這種治療的患者，在功能和疼痛上有了顯著的改變，術(shù)后MRI評(píng)估顯示62%的患者細(xì)胞載體完全融合，57%的患者軟骨缺損完全得到填充。但是目前在美國(guó)，hyalograftC移植尚未被允許。在一項(xiàng)研究中，海藻酸鈉被用于細(xì)胞載體，接種在21例成人的同種異體軟骨細(xì)胞移植[22]。在平均6.3年的隨訪中，臨床評(píng)分包括Western Ontario and M cMaster Universities骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)和VAS視覺(jué)模擬量表評(píng)分均明顯改善。有4例并發(fā)癥報(bào)告，包括骨膜瓣修復(fù)組織松散、分層，臨床功能下降以及對(duì)修復(fù)組織的可視化的MRI顯示減薄。盡管存在這些并發(fā)癥，開(kāi)發(fā)基于碳水化合物的聚合物作為軟骨細(xì)胞載體材料仍有相當(dāng)可觀的前景。

3.3 合成聚合物

組織工程學(xué)中的合成聚合物細(xì)胞載體，目前以采用聚乳酸[23]、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯[24]和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）[25]最為常見(jiàn)，并且這些材料可以進(jìn)行編織或制作成為靜電紡絲納米纖維。

一項(xiàng)使用含PLGA、聚乙醇酸和硫酸鈣的合成聚合物細(xì)胞載體的組織工程治療軟骨損傷的研究中，

將使用上訴細(xì)胞載體的組織植入到患者的髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損處，患者術(shù)后進(jìn)行為期2年的隨訪[26]。該研究證明這樣的措施可有效改善短期的狀況。然而，這種細(xì)胞載體植入后的軟骨下骨無(wú)法修復(fù)，甚至?xí)?dǎo)致透明軟骨的形成。

PLGA也已與硫酸鈣結(jié)合成在商業(yè)上通過(guò)許可的TruFitPlug（Sm ith&Nephew），一種合成的可吸收植入物，可促進(jìn)軟骨和骨成長(zhǎng)。聚乳酸作為軟骨修復(fù)裝置中的細(xì)胞載體（Kensey Nash），其中包含β-磷酸三鈣刺激骨的生長(zhǎng)和I型膠原結(jié)構(gòu)來(lái)刺激軟骨的生長(zhǎng)[27]。這個(gè)載體在歐洲于2010年被批準(zhǔn)使用，在美國(guó)于2012年被批準(zhǔn)使用。

最近，Tsai等[28]又提出了一種新的合成聚合物材料，即由陰離子聚氨酯制成的可生物降解的彈性載體。該載體較傳統(tǒng)的PLA載體具有更強(qiáng)的變形恢復(fù)能力和延展性。將軟骨細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植其上后，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)明顯較傳統(tǒng)載體更好、更快。

3.4 其他細(xì)胞載體材料

其他細(xì)胞支架材料包括聚丁酸、碳纖維、滌綸和聚四氟乙烯等。陶瓷，如羥基磷灰石、磷酸三鈣和生物活性玻璃，也被正在開(kāi)發(fā)的支架再植技術(shù)列入考慮，由于這些材料促進(jìn)骨磷灰石層生長(zhǎng)，通過(guò)軟骨細(xì)胞載體固定及覆蓋骨軟骨的缺損。Steel等[29]的研究表明，雙分子層膜的細(xì)胞載體能模擬軟骨的一些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特性，從而有利于軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，且較同類(lèi)的微載體有明顯優(yōu)勢(shì)。Kim等[30]的研究則表明，封裝有TGF-β因子的PLCL載體可以有效的適用于軟骨修復(fù)的組織工程中。Cunniffe等[31]的研究則顯示了多孔的脫細(xì)胞載體材料可用于治療大塊的軟骨缺損。

最近的一項(xiàng)研究采用膝關(guān)節(jié)的軟骨或骨軟骨使用一個(gè)三維細(xì)胞載體進(jìn)行軟骨缺陷治療（MaioRegen，F(xiàn)in-Ceram ica Faenza SpA），這種骨和軟骨細(xì)胞載體為Ⅰ型膠原原纖維和納米羥基磷灰石[32]所治療的患者軟骨缺陷的大小范圍可從1.5 cm2到6 cm2。在為期2年的隨訪中，患者臨床評(píng)分均有改善，尤其是積極的患者。MRI評(píng)估顯示有70%的病例有完整的植骨融合。目前，一個(gè)進(jìn)一步使用這種細(xì)胞載體治療骨軟骨缺損的大范圍的多中心臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢跉W洲展開(kāi)[33]。使用細(xì)胞載體來(lái)治療軟骨損傷和病變的治療方式正逐漸普及[34]。

4 總結(jié)與展望

在軟骨修復(fù)重建的組織工程中，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞載體還是十分有必要的。根據(jù)不同需求研發(fā)并改進(jìn)出不同的細(xì)胞載體材料，也是十分有前景的。目前對(duì)細(xì)胞載體的研究已經(jīng)取得了一定的成果，研發(fā)出了各種滿足一定要求的細(xì)胞載體材料，并且其中的一些已經(jīng)成為應(yīng)用于治療臨床的人體軟骨損傷或病變的有效手段，并在臨床中在某些方面顯現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。Ahn等[35]甚至已經(jīng)研究出使用3D打印技術(shù)可以批量機(jī)械化生產(chǎn)細(xì)胞載體。但目前的細(xì)胞載體材料還不能滿足全部需求，還存在各種難以避免的缺點(diǎn)，如何使細(xì)胞載體材料能夠用于治療更多的軟骨損傷或病變患者，并增加其治療的效果，減少其可能帶來(lái)的不良反應(yīng)，將會(huì)是今后研究的重點(diǎn)。

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2095-9958（2015）08-0 367-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.04-022

上海市科委自然基金課題（項(xiàng)目編號(hào)：15ZR1431900）

**通信作者：施忠民，E-mail：18930177323@163.com