譚明輝　霍光華

摘要：采用單因素和正交設(shè)計試驗，研究無患子（Sapindus mukorossi）總皂苷的提取工藝，得出無患子總皂苷的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間為3.5 h，溫度為70 ℃，料液比為1∶5，在此條件下無患子總皂苷的提取率為21.23%。抑菌試驗表明，無患子粉末、水提取液和乙醇提取液對稻瘟病菌的EC50分別為0.21、0.18、0.12 mg/mL。利用大孔樹脂對無患子乙醇提取液除雜，結(jié)果表明抑菌活性部位主要集中于70%乙醇洗脫液部位，在濃度為0.05 mg/mL時，其抑菌活性達(dá)到95.94%。

關(guān)鍵詞：無患子（Sapindus mukorossi）；皂苷；提取工藝；抑菌活性

中圖分類號：TQ281 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5511-04

無患子（Sapindus mukorossi）是無患子科無患子屬的落葉喬木，國外廣泛分布在日本、朝鮮等東南亞國家，國內(nèi)各省皆有分布[1]。無患子在不同的地方有不同的叫法，在臺灣被稱為目浪樹，在海南被稱為苦患樹，而在江西、廣東和湖南都被稱為肥珠子。無患子具有十分廣泛的應(yīng)用價值，其樹型美觀可以吸收汽車尾氣；其種仁含油率高，是一種新型的制備生物柴油的原料[2]；其果實中的皂苷具有極強(qiáng)的非離子表面活性，可作為天然洗滌劑。此外，無患子還具有十分重要的醫(yī)學(xué)價值，能夠用于喉痹腫痛、咳喘、白帶、瘡癬、腫瘤等的治療[3]。

現(xiàn)代研究表明，無患子果皮中含有大量的皂苷，主要是三萜皂苷類[4-7]。目前，關(guān)于無患子皂苷的提取主要以水提法為主，但水提法容易使無患子中其他雜質(zhì)浸出，從而導(dǎo)致無患子皂苷純度降低。魏玉鳳等[8]研究了水提-大孔樹脂吸附法提取，并用超濾法分離提純無患子皂苷；饒厚曾等[9]介紹了微波萃取法提取無患子皂苷的工藝。上述研究雖然對無患子皂苷的提取提出了一些新方法，但因其溶劑消耗量大、能耗高和產(chǎn)品純度低等缺點，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本試驗采用單因素試驗和正交試驗的方法對無患子總皂苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，同時研究了無患子總皂苷的抗稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）活性，以期為無患子皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，同時為開發(fā)新型植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無患子采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源保護(hù)與利用研究所分類鑒定。無患子果晾干后，去核，將果皮用粉碎機(jī)粉碎并過40目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

稻瘟病菌由南昌市生物資源保護(hù)與利用重點實驗室提供，齊墩果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸、D101大孔吸附樹脂購于天津農(nóng)藥廠，無水乙醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

AR1530/C型電子分析天平（奧豪斯上海有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取干燥的齊墩果酸10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，備用；精密稱取香草醛0.500 0 g，用冰乙酸溶解并定容至10 mL，備用；分別精密吸取齊墩果酸甲醇溶液0、40、80、120、160、200、240 μL于比色管中，每組3次重復(fù)，水浴加熱溶劑，先后加入配好的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL（顯色劑），充分搖勻，于70 ℃水浴加熱20 min，取出后立即浸入冰水浴中冷卻2～3 min，加入5 mL冰乙酸，在540 nm波長處測定其吸光度。

1.3.2 提取液皂苷含量測定[10] 用移液槍吸取一定體積的提取液，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定樣品提取液的吸光度，以去離子水為空白對照。

1.3.3 單因素試驗 稱取無患子粉末5.00 g， 在不同提取時間、提取溫度、料液比（m/V，g∶mL，下同）和乙醇體積分?jǐn)?shù)下提取。分別考察上述各因素對無患子總皂苷提取率和浸出率的影響。提取率和浸出率的計算公式如下：

提取率=■×100%

浸出率=■×100%

1.3.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、料液比（C）和提取時間（D）進(jìn)行L9（34）正交試驗，試驗因素與水平見表1。

1.3.5 大孔吸附樹脂純化無患子皂苷 大孔吸附樹脂的預(yù)處理按文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。

上樣：稱取無患子粉末20.00 g，按正交試驗所得最佳工藝進(jìn)行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，吸取10 mL（濃度為0.22 g/mL）上樣于預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱內(nèi)，預(yù)吸附1 h， 然后分別用2倍柱體積的去離子水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，測定各洗脫液中皂苷含量。

1.3.6 無患子抑菌活性研究 稱取一定量的無患子粉末，配成一系列不同濃度的含藥平板，同時設(shè)置空白對照，用7 mm打孔器接種稻瘟病菌，28 ℃下培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，計算抑菌率。將無患子水提液、乙醇提取液和經(jīng)大孔樹脂純化后的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍真空干燥后按同樣的方法測定其抑菌活性。抑菌率的計算公式如下：

抑菌率=■×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計方法

每組試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。利用Origin 8.5繪圖；采用SPSS 17.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。經(jīng)回歸分析，得回歸方程為y=0.002 1x-0.008 0，R2=0.997 7，線性關(guān)系較好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對無患子總皂苷提取率的影響 在25 ℃下，以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取時，不同提取時間對無患子總皂苷提取率的影響見表2。由表2可知，不同提取時間對無患子總皂苷提取率有顯著影響。隨著提取時間的延長，原料中的總皂苷擴(kuò)散到溶液中的量增加，即提取率逐漸增加；當(dāng)時間達(dá)到4.5 h以后，提取率增加變緩進(jìn)而趨于平衡。浸出率也受時間的顯著影響，隨著提取時間的增加，浸出率逐漸升高，從1.5 h的19.19%升高到5.5 h的28.78%，最后達(dá)到平衡狀態(tài)。由此可以看出，為達(dá)到總皂苷提取率最大，最佳提取時間設(shè)定為4.5 h。

2.2.2 溫度對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h，不同提取溫度對無患子總皂苷提取率的影響見表3。由表3可以看出，溫度對無患子總皂苷提取率存在顯著差異?？傇碥仗崛÷孰S著溫度的升高呈增大趨勢，由25 ℃的11.72%增大到70 ℃的14.81%。當(dāng)溫度升高到80 ℃時，提取率下降為14.45%，但仍高于25℃的提取率。浸出率隨著溫度的升高同樣呈增大趨勢。25 ℃浸出率為28.60%，80 ℃為46.02%。這可能是由于溫度過高導(dǎo)致無患子果皮中的其他成分被浸出所致。

2.2.3 料液比對無患子總皂苷提取率的影響 在70 ℃下，以60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h， 不同料液比對無患子總皂苷提取率的影響見表4。從表4可以看出，料液比的不同對無患子總皂苷的提取率有顯著影響。隨著料液比的降低，無患子總皂苷提取率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比下降到1∶6后，提取率逐漸趨于平緩。浸出率同樣表現(xiàn)出類似的情況，隨著料液比的下降，浸出率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比為1∶7時，浸出率仍然在增大，這可能是無患子中的其他成分被乙醇提取出來。因此，考慮到無患子總皂苷的純度問題，料液比應(yīng)選為1∶5。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶5的料液比，在70 ℃提取4.5 h，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響見表5。由表5可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對無患子總皂苷提取率存在顯著影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，無患子總皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時，提取率開始逐漸下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%提取率下降到11.34%。浸出率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，浸出率逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時，浸出率下降為24.53%。由此可以說明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時有利于無患子總皂苷的提取。

2.3 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗進(jìn)一步考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間4個因素對無患子總皂苷提取率的影響，結(jié)果見表6。由極差分析可知，各因素對無患子總皂苷提取率的影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比，最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶5，提取時間為3.5 h，在該條件下無患子總皂苷提取率為21.23%。

2.4 無患子總皂苷的抑菌活性

無患子粉末、無患子水提取液和無患子乙醇提取液對稻瘟病菌的抑菌活性見表7。從表7可以看出，無患子具有較強(qiáng)的抑制稻瘟病菌活性。其中，乙醇提取液的抑菌活性強(qiáng)于水提取液，EC50為0.12 mg/mL。

無患子乙醇提取液經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，各洗脫部位的皂苷含量和抑菌活性見表8。從表8中可以看出，大孔吸附樹脂能除去較多雜質(zhì)，使無患子總皂苷的純度有了較大的提高。同時，在皂苷濃度為0.05 mg/mL時，70%乙醇洗脫液對稻瘟病菌的抑菌率達(dá)到了95.94%，相比無患子粉末和無患子乙醇提取液的抑菌活性均有較大的提高。

3 小結(jié)與討論

無患子皂苷具有十分廣泛的應(yīng)用價值，但其分離純化存在一定的困難，導(dǎo)致其工業(yè)化生產(chǎn)受阻。本研究采用單因素試驗，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間對無患子總皂苷提取率的影響，并用正交試驗優(yōu)化了提取工藝。最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃，料液比1∶5，提取時間3.5 h，此時無患子總皂苷的提取率為21.23%。大孔吸附樹脂對無患子總皂苷進(jìn)行純化，可以除去乙醇提取液中的糖類等水溶性雜質(zhì)。醇提-大孔吸附樹脂分離純化無患子皂苷具有成本低，產(chǎn)品得率高，工藝簡單等優(yōu)點，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。抑菌試驗研究表明，無患子具有較強(qiáng)的抗稻瘟病菌活性，這主要是由于無患子果皮中富含三萜皂苷。本研究為無患子皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。同時，也為無患子作為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了參考。有關(guān)無患子皂苷單體的分離純化以及無患子皂苷的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] NAKAYAMA K， FUJINO H， KASAI R， et al. Solubilizing properties of saponins from Sapindus mukurossi Gaertn[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo）， 1986， 34（8）：3279-3283.

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[11] 馬育彪，何宇新，彭鐮心，等. 無患子皂苷的大孔吸附樹脂分離純化工藝[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011， 17（8）： 23-25.

（責(zé)任編輯 龍小玲）

2.2.1 提取時間對無患子總皂苷提取率的影響 在25 ℃下，以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取時，不同提取時間對無患子總皂苷提取率的影響見表2。由表2可知，不同提取時間對無患子總皂苷提取率有顯著影響。隨著提取時間的延長，原料中的總皂苷擴(kuò)散到溶液中的量增加，即提取率逐漸增加；當(dāng)時間達(dá)到4.5 h以后，提取率增加變緩進(jìn)而趨于平衡。浸出率也受時間的顯著影響，隨著提取時間的增加，浸出率逐漸升高，從1.5 h的19.19%升高到5.5 h的28.78%，最后達(dá)到平衡狀態(tài)。由此可以看出，為達(dá)到總皂苷提取率最大，最佳提取時間設(shè)定為4.5 h。

2.2.2 溫度對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h，不同提取溫度對無患子總皂苷提取率的影響見表3。由表3可以看出，溫度對無患子總皂苷提取率存在顯著差異?？傇碥仗崛÷孰S著溫度的升高呈增大趨勢，由25 ℃的11.72%增大到70 ℃的14.81%。當(dāng)溫度升高到80 ℃時，提取率下降為14.45%，但仍高于25℃的提取率。浸出率隨著溫度的升高同樣呈增大趨勢。25 ℃浸出率為28.60%，80 ℃為46.02%。這可能是由于溫度過高導(dǎo)致無患子果皮中的其他成分被浸出所致。

2.2.3 料液比對無患子總皂苷提取率的影響 在70 ℃下，以60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h， 不同料液比對無患子總皂苷提取率的影響見表4。從表4可以看出，料液比的不同對無患子總皂苷的提取率有顯著影響。隨著料液比的降低，無患子總皂苷提取率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比下降到1∶6后，提取率逐漸趨于平緩。浸出率同樣表現(xiàn)出類似的情況，隨著料液比的下降，浸出率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比為1∶7時，浸出率仍然在增大，這可能是無患子中的其他成分被乙醇提取出來。因此，考慮到無患子總皂苷的純度問題，料液比應(yīng)選為1∶5。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶5的料液比，在70 ℃提取4.5 h，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響見表5。由表5可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對無患子總皂苷提取率存在顯著影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，無患子總皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時，提取率開始逐漸下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%提取率下降到11.34%。浸出率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，浸出率逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時，浸出率下降為24.53%。由此可以說明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時有利于無患子總皂苷的提取。

2.3 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗進(jìn)一步考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間4個因素對無患子總皂苷提取率的影響，結(jié)果見表6。由極差分析可知，各因素對無患子總皂苷提取率的影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比，最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶5，提取時間為3.5 h，在該條件下無患子總皂苷提取率為21.23%。

2.4 無患子總皂苷的抑菌活性

無患子粉末、無患子水提取液和無患子乙醇提取液對稻瘟病菌的抑菌活性見表7。從表7可以看出，無患子具有較強(qiáng)的抑制稻瘟病菌活性。其中，乙醇提取液的抑菌活性強(qiáng)于水提取液，EC50為0.12 mg/mL。

無患子乙醇提取液經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，各洗脫部位的皂苷含量和抑菌活性見表8。從表8中可以看出，大孔吸附樹脂能除去較多雜質(zhì)，使無患子總皂苷的純度有了較大的提高。同時，在皂苷濃度為0.05 mg/mL時，70%乙醇洗脫液對稻瘟病菌的抑菌率達(dá)到了95.94%，相比無患子粉末和無患子乙醇提取液的抑菌活性均有較大的提高。

3 小結(jié)與討論

無患子皂苷具有十分廣泛的應(yīng)用價值，但其分離純化存在一定的困難，導(dǎo)致其工業(yè)化生產(chǎn)受阻。本研究采用單因素試驗，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間對無患子總皂苷提取率的影響，并用正交試驗優(yōu)化了提取工藝。最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃，料液比1∶5，提取時間3.5 h，此時無患子總皂苷的提取率為21.23%。大孔吸附樹脂對無患子總皂苷進(jìn)行純化，可以除去乙醇提取液中的糖類等水溶性雜質(zhì)。醇提-大孔吸附樹脂分離純化無患子皂苷具有成本低，產(chǎn)品得率高，工藝簡單等優(yōu)點，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。抑菌試驗研究表明，無患子具有較強(qiáng)的抗稻瘟病菌活性，這主要是由于無患子果皮中富含三萜皂苷。本研究為無患子皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。同時，也為無患子作為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了參考。有關(guān)無患子皂苷單體的分離純化以及無患子皂苷的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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[8] 魏玉鳳，解 輝，余錦城，等. 超濾法分離提純無患子皂苷[J]. 膜科學(xué)與技術(shù)，2008（2）：85-88.

[9] 饒厚曾，桑成濤. 微波萃取法提取無患子皂苷工藝[J]. 遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報，2006， 26（4）：70-72.

[10] 唐青濤，邱海燕，廖偉玲，等. 紫外分光法測定無患子果皮中總皂苷的含量[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008， 20（5）： 84-86.

[11] 馬育彪，何宇新，彭鐮心，等. 無患子皂苷的大孔吸附樹脂分離純化工藝[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011， 17（8）： 23-25.

（責(zé)任編輯 龍小玲）

2.2.1 提取時間對無患子總皂苷提取率的影響 在25 ℃下，以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取時，不同提取時間對無患子總皂苷提取率的影響見表2。由表2可知，不同提取時間對無患子總皂苷提取率有顯著影響。隨著提取時間的延長，原料中的總皂苷擴(kuò)散到溶液中的量增加，即提取率逐漸增加；當(dāng)時間達(dá)到4.5 h以后，提取率增加變緩進(jìn)而趨于平衡。浸出率也受時間的顯著影響，隨著提取時間的增加，浸出率逐漸升高，從1.5 h的19.19%升高到5.5 h的28.78%，最后達(dá)到平衡狀態(tài)。由此可以看出，為達(dá)到總皂苷提取率最大，最佳提取時間設(shè)定為4.5 h。

2.2.2 溫度對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶3的料液比，60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h，不同提取溫度對無患子總皂苷提取率的影響見表3。由表3可以看出，溫度對無患子總皂苷提取率存在顯著差異?？傇碥仗崛÷孰S著溫度的升高呈增大趨勢，由25 ℃的11.72%增大到70 ℃的14.81%。當(dāng)溫度升高到80 ℃時，提取率下降為14.45%，但仍高于25℃的提取率。浸出率隨著溫度的升高同樣呈增大趨勢。25 ℃浸出率為28.60%，80 ℃為46.02%。這可能是由于溫度過高導(dǎo)致無患子果皮中的其他成分被浸出所致。

2.2.3 料液比對無患子總皂苷提取率的影響 在70 ℃下，以60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取4.5 h， 不同料液比對無患子總皂苷提取率的影響見表4。從表4可以看出，料液比的不同對無患子總皂苷的提取率有顯著影響。隨著料液比的降低，無患子總皂苷提取率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比下降到1∶6后，提取率逐漸趨于平緩。浸出率同樣表現(xiàn)出類似的情況，隨著料液比的下降，浸出率呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)料液比為1∶7時，浸出率仍然在增大，這可能是無患子中的其他成分被乙醇提取出來。因此，考慮到無患子總皂苷的純度問題，料液比應(yīng)選為1∶5。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響 以1∶5的料液比，在70 ℃提取4.5 h，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對無患子總皂苷提取率的影響見表5。由表5可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對無患子總皂苷提取率存在顯著影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，無患子總皂苷提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時，提取率開始逐漸下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%提取率下降到11.34%。浸出率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，浸出率逐漸增大，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時，浸出率下降為24.53%。由此可以說明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時有利于無患子總皂苷的提取。

2.3 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗進(jìn)一步考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間4個因素對無患子總皂苷提取率的影響，結(jié)果見表6。由極差分析可知，各因素對無患子總皂苷提取率的影響順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比，最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶5，提取時間為3.5 h，在該條件下無患子總皂苷提取率為21.23%。

2.4 無患子總皂苷的抑菌活性

無患子粉末、無患子水提取液和無患子乙醇提取液對稻瘟病菌的抑菌活性見表7。從表7可以看出，無患子具有較強(qiáng)的抑制稻瘟病菌活性。其中，乙醇提取液的抑菌活性強(qiáng)于水提取液，EC50為0.12 mg/mL。

無患子乙醇提取液經(jīng)大孔吸附樹脂純化后，各洗脫部位的皂苷含量和抑菌活性見表8。從表8中可以看出，大孔吸附樹脂能除去較多雜質(zhì)，使無患子總皂苷的純度有了較大的提高。同時，在皂苷濃度為0.05 mg/mL時，70%乙醇洗脫液對稻瘟病菌的抑菌率達(dá)到了95.94%，相比無患子粉末和無患子乙醇提取液的抑菌活性均有較大的提高。

3 小結(jié)與討論

無患子皂苷具有十分廣泛的應(yīng)用價值，但其分離純化存在一定的困難，導(dǎo)致其工業(yè)化生產(chǎn)受阻。本研究采用單因素試驗，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間對無患子總皂苷提取率的影響，并用正交試驗優(yōu)化了提取工藝。最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70 ℃，料液比1∶5，提取時間3.5 h，此時無患子總皂苷的提取率為21.23%。大孔吸附樹脂對無患子總皂苷進(jìn)行純化，可以除去乙醇提取液中的糖類等水溶性雜質(zhì)。醇提-大孔吸附樹脂分離純化無患子皂苷具有成本低，產(chǎn)品得率高，工藝簡單等優(yōu)點，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。抑菌試驗研究表明，無患子具有較強(qiáng)的抗稻瘟病菌活性，這主要是由于無患子果皮中富含三萜皂苷。本研究為無患子皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。同時，也為無患子作為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了參考。有關(guān)無患子皂苷單體的分離純化以及無患子皂苷的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 龍小玲）