龔萍　楊宇　楊永平　等

摘要：將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達載體RCASBP-GFP-SMARCE1包裝為病毒顆粒，并測定其病毒滴度。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在DF-1細胞系中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，收集上清液，超速離心濃縮病毒，用GFP標記法測定病毒滴度。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后3～4 d可見少許GFP陽性細胞的出現(xiàn)，6～7 d后所有細胞均有GFP的表達，11 d左右細胞達到超匯合狀態(tài)，開始收集上清液；GFP標記法測定超速離心后的病毒滴度為5×1010 IU/mL。結(jié)果表明，成功制備了高滴度的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，為下一步在胚胎中進行相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；病毒包裝；綠色熒光蛋白；病毒滴度

中圖分類號：S852.65+9.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5470-04

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因治療和基因功能的研究。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類含有逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNA 病毒，分為慢病毒亞科（如人類免疫缺陷病毒）、腫瘤病毒亞科（如禽類勞氏肉瘤病毒）和泡沫病毒亞科（如人泡沫病毒）三類[1]。逆轉(zhuǎn)錄病毒具有3個基本的結(jié)構(gòu)基因Gag、Env和pol，分別編碼病毒的核心蛋白、病毒的包膜糖蛋白和逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)寄主細胞表面的受體蛋白識別后進入細胞，然后在自身基因組編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以基因組RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄出雙鏈DNA原病毒，雙鏈DNA能隨機整合到寄主細胞的染色體上，隨著寄主細胞的復(fù)制而復(fù)制[2]。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體大多基于禽類或獸類病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點使其成為基因轉(zhuǎn)移載體的最佳選擇，如宿主細胞范圍廣，對細胞的感染率高，插入的外源基因可完整地整合等。目前在禽類中應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要來源于禽類白血病病毒（Avian leucosis virus，ALV）、禽類勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）以及慢病毒（Lentivirus）等[3，4]。其中慢病毒與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，具有更廣的宿主范圍，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，但慢病毒表達的時間較慢，且慢病毒是“自殺性”病毒，即病毒感染靶細胞后，不再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。而以禽肉瘤白血病病毒（Avian sarcoma leucosis virus，ASLV）為骨架的逆轉(zhuǎn)錄病毒RCASBP（Replication-competent avian sarcoma-leukosis virus，with a splice acceptor，bryan RSV pol）是一種具有自我復(fù)制能力的病毒，既能水平感染相鄰細胞，也能垂直感染后代細胞[5]，近年來在雞胚發(fā)育相關(guān)基因的功能研究中得到廣泛應(yīng)用[6-8]。本研究擬將本課題組前期構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒融合蛋白表達載體在DF-1細胞系中包裝病毒顆粒并測定病毒滴度，以期獲得高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒，為進一步在細胞模型和雞胚模型中研究相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒與細胞 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RCASBP.B由美國Cliff Tabin教授（Harvard Medical School）惠贈、重組載體RCASBP.B-GFP-SMARCE1（簡稱RGS）由本實驗室構(gòu)建并保存、雞胚成纖維細胞系UMNSAH/DF-1購自美國ATCC（CRL-12203）。

1.1.2 主要試劑 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)miga公司；Lipofectemine 2000、Opti-MEMⅠ低血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；無噬菌體、低內(nèi)毒素的胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自ATCC；青霉素/鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶購自杭州吉諾公司。

1.2 方法

1.2.1 DF-1細胞的解凍與傳代 從干冰中迅速取出購買的雞胚成纖維細胞系DF-1凍存管，立即在39 ℃水浴鍋中解凍（最好在2 min內(nèi)完成）；在超凈工作臺內(nèi)將管內(nèi)液體轉(zhuǎn)至含有9 mL預(yù)熱生長培養(yǎng)基（含有10.0%胎牛血清和1.0%雙抗的DMEM）的尖頭離心管中，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，用10 mL預(yù)熱生長培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，在39 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在不同時間觀察細胞生長情況，待細胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3的比例分瓶培養(yǎng)。

1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與病毒包裝 在轉(zhuǎn)染前1 d胰酶消化法將DF-1細胞接種到10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞80.0%-90.0%匯合時將20 μg無內(nèi)毒素質(zhì)粒與40 μL Lipofectamine 2 000分別用Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋后混合，轉(zhuǎn)染DF-1細胞，加入含10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后換為生長培養(yǎng)基，待細胞長滿后傳代至15 cm培養(yǎng)皿中；期間觀察細胞生長及綠色熒光蛋白表達情況，最后將細胞傳至6個15 cm培養(yǎng)皿中；待細胞匯合后36～48 h換用1/10的生長培養(yǎng)基（含有1.0%胎牛血清和0.1%雙抗的DMEM）；換液24 h后收集上清液于50 mL離心管中，離心管于液氮中保存，細胞中繼續(xù)加入1/10的生長培養(yǎng)基，如此重復(fù)，連續(xù)收集病毒上清液3 d。

1.2.3 病毒的濃縮 將上述收集病毒上清液的離心管于37 ℃水浴鍋中迅速解凍后置于冰上，在超凈工作臺內(nèi)用0.45 μm的濾器過濾去除細胞碎片；轉(zhuǎn)移上清液至超速離心管中， 4 ℃下27 000 r/min超速離心3 h；棄上清液，加入100～300 μL DMEM原液，將離心管置于冰上振蕩重懸過夜；待病毒沉淀完全溶解后吹打均勻，分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 病毒滴度的測定 將DF-1細胞接種于24孔板中，第二天用DMEM原液按10倍梯度稀釋病毒液，即在EP管中先加入90 μL DMEM，往第一個管中加入10 μL病毒原液，混勻后，吸取10 μL加入第二個管混勻，依此類推，梯度稀釋至10-8；每孔細胞加入100 μL稀釋的病毒液，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，并設(shè)置陰性對照組（即不加病毒液）；在不同時間觀察細胞生長情況，并追加生長培養(yǎng)基，利于細胞的生長；48 h后觀察各孔中GFP的表達，計算病毒滴度（IU/mL）[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DF-1細胞的培養(yǎng)

DF-1細胞系解凍復(fù)蘇后傳代，待細胞生長穩(wěn)定后再進行轉(zhuǎn)染。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，解凍的細胞從圓形慢慢伸展開來變成纖維狀，如圖1所示，解凍后12 h有部分細胞已伸展開來，此時的死細胞較多，隨著細胞的增殖，到解凍后36 h細胞已長滿；傳代后的細胞生長良好，具有典型的成纖維細胞形態(tài)，傳代后24 h即鋪滿瓶底，可用于傳代。

2.2 病毒的包裝

在轉(zhuǎn)染后不同時間觀察細胞的生長狀態(tài)及綠色熒光蛋白的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞生長良好，轉(zhuǎn)染后2～4 d可見少許GFP陽性細胞的出現(xiàn)，之后GFP陽性細胞數(shù)量越來越多，熒光的亮度越來越強；轉(zhuǎn)染后7～8 d所有的細胞都有綠色熒光蛋白的表達；轉(zhuǎn)染后11 d左右，15 cm培養(yǎng)皿中的細胞已達到超匯合狀態(tài)，此時收集上清液即含有較多病毒顆粒；在高倍鏡下觀察細胞質(zhì)和細胞核中均有較強熒光信號（圖2）。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的測定

將濃縮的病毒液，從10-3到10-8逐級稀釋后感染DF-1細胞，48 h后觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，如圖3所示，10-3中大部分細胞為GFP陽性細胞，之后逐級減少，到10-8時僅有少數(shù)細胞有綠色熒光信號，計算病毒滴度為5×1010 IU/mL，達到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 討論

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。病毒滴度的測定是病毒載體應(yīng)用過程中十分重要的步驟，為保證病毒具有較高的感染效率，須達到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度應(yīng)至少達到108 IU/mL，才能在禽類胚胎中迅速感染[9]。目前測定病毒滴度的方法有很多種，如細胞病變法、空斑法、OD260 nm法、殼蛋白免疫法、熒光定量PCR法和GFP標記法等[10-12]。其中細胞病變法和空斑法是最傳統(tǒng)的方法，操作耗時且穩(wěn)定性不好；OD260 nm法是測定病毒顆粒在260 nm處的吸光度，耗時短、成本低且穩(wěn)定，但不能區(qū)分感染性和缺陷性病毒顆粒，故應(yīng)用價值有限[11]；殼蛋白免疫法是最為標準、結(jié)果最為可靠的方法，但其對試劑的要求及成本較高；熒光定量PCR法是對病毒液中的完整病毒顆粒數(shù)進行精確的定量[13]，操作簡單、成本適中，但結(jié)果并不十分可靠，因為并非所有完整的病毒顆粒均具有感染力；GFP標記法是直接在顯微鏡下觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，操作簡單、成本低、耗時短、穩(wěn)定性好，但只適用于帶有GFP標簽的病毒載體。孫鵬宇等[11]比較了上述幾種不同的測定方法，發(fā)現(xiàn)GFP標記法與傳統(tǒng)的細胞病變法及標準的殼蛋白免疫法的測定結(jié)果差異不顯著。因此，在測定帶有GFP標簽的病毒滴度時，GFP標記法是最為快速、有效且成本低廉的方法；不帶GFP標簽的病毒載體在不影響其他功能的情況下，最好能引入GFP標簽，可為后續(xù)試驗帶來便利。如本研究在構(gòu)建靶基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，引入GFP標簽構(gòu)建成融合蛋白表達載體，測定病毒滴度時即采用GFP標記法進行；另外，引入的GFP標簽也可為后續(xù)細胞模型和胚胎模型中的研究帶來直觀的結(jié)果。

本研究成功制備了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，為下一步在胚胎中進行相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] ISHII Y， REESE D E， MIKAWA T. Somatic transgenesis using retroviral vectors in the chicken embryo[J]. Dev Dyn， 2004， 229（3）： 630-642.

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[3] SMITH C A， ROESZLER K N， SINCLAIR A H. Robust and ubiquitous GFP expression in a single generation of chicken embryos using the avian retroviral vector， RCASBP[J]. Differentiation， 2009， 77（5）：473-482.

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[5] GORDON C T， RODDA F A， FARLIE P G. The RCAS retroviral expression system in the study of skeletal development[J]. Dev Dyn，2009，238（4）：797-811.

[6] SMITH C A， ROESZLER K N， OHNESORG T， et al. The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken[J]. Nature， 2009， 461（7261）： 267-271.

[7] GONG P， YANG Y P， YANG Y， et al. Different gene transfer methods at the very early， early， late and whole embryonic stages in chicken[J]. Acta Biol Hung， 2012， 63（4）： 453-462.

[8] LAMBETH L S， CUMMINS D M， DORAN T J， et al. Overexpression of aromatase alone is sufficient for ovarian development in genetically male chicken embryos[J]. PLoS One， 2013， 8（6）： e68362.

[9] LOGAN M， TABIN C. Targeted gene misexpression in chick limb buds using avian replication-competent retroviruses[J]. Methods， 1998， 14（4）： 407-420.

[10] THOMAS MA， LICHTENSTEIN DL， KRAJCSI P， et al. A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks[J]. Methods Mol Med， 2007， 130： 185-192.

[11] 孫鵬宇，張艷玲，荊玉明，等.腺病毒滴度不同測定方法比較[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31（2）：234-238.

[12] 鐘艷平，林若蕓，黎丹戎，等.HTERT重組第三代慢病毒載體的構(gòu)建及其病毒包裝鑒定[J].中國生物工程雜志，2011，31（9）：21-27.

[13] MAGALDI T G， BUCH M H， MURATA H， et al. Mutations in the GM1 binding site of simian virus 40 VP1 alter receptor usage and cell tropism[J]. J Virol， 2012， 86（13）： 7028-7042.

（責(zé)任編輯 程碧軍）

2 結(jié)果與分析

2.1 DF-1細胞的培養(yǎng)

DF-1細胞系解凍復(fù)蘇后傳代，待細胞生長穩(wěn)定后再進行轉(zhuǎn)染。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，解凍的細胞從圓形慢慢伸展開來變成纖維狀，如圖1所示，解凍后12 h有部分細胞已伸展開來，此時的死細胞較多，隨著細胞的增殖，到解凍后36 h細胞已長滿；傳代后的細胞生長良好，具有典型的成纖維細胞形態(tài)，傳代后24 h即鋪滿瓶底，可用于傳代。

2.2 病毒的包裝

在轉(zhuǎn)染后不同時間觀察細胞的生長狀態(tài)及綠色熒光蛋白的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞生長良好，轉(zhuǎn)染后2～4 d可見少許GFP陽性細胞的出現(xiàn)，之后GFP陽性細胞數(shù)量越來越多，熒光的亮度越來越強；轉(zhuǎn)染后7～8 d所有的細胞都有綠色熒光蛋白的表達；轉(zhuǎn)染后11 d左右，15 cm培養(yǎng)皿中的細胞已達到超匯合狀態(tài)，此時收集上清液即含有較多病毒顆粒；在高倍鏡下觀察細胞質(zhì)和細胞核中均有較強熒光信號（圖2）。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的測定

將濃縮的病毒液，從10-3到10-8逐級稀釋后感染DF-1細胞，48 h后觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，如圖3所示，10-3中大部分細胞為GFP陽性細胞，之后逐級減少，到10-8時僅有少數(shù)細胞有綠色熒光信號，計算病毒滴度為5×1010 IU/mL，達到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 討論

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。病毒滴度的測定是病毒載體應(yīng)用過程中十分重要的步驟，為保證病毒具有較高的感染效率，須達到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度應(yīng)至少達到108 IU/mL，才能在禽類胚胎中迅速感染[9]。目前測定病毒滴度的方法有很多種，如細胞病變法、空斑法、OD260 nm法、殼蛋白免疫法、熒光定量PCR法和GFP標記法等[10-12]。其中細胞病變法和空斑法是最傳統(tǒng)的方法，操作耗時且穩(wěn)定性不好；OD260 nm法是測定病毒顆粒在260 nm處的吸光度，耗時短、成本低且穩(wěn)定，但不能區(qū)分感染性和缺陷性病毒顆粒，故應(yīng)用價值有限[11]；殼蛋白免疫法是最為標準、結(jié)果最為可靠的方法，但其對試劑的要求及成本較高；熒光定量PCR法是對病毒液中的完整病毒顆粒數(shù)進行精確的定量[13]，操作簡單、成本適中，但結(jié)果并不十分可靠，因為并非所有完整的病毒顆粒均具有感染力；GFP標記法是直接在顯微鏡下觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，操作簡單、成本低、耗時短、穩(wěn)定性好，但只適用于帶有GFP標簽的病毒載體。孫鵬宇等[11]比較了上述幾種不同的測定方法，發(fā)現(xiàn)GFP標記法與傳統(tǒng)的細胞病變法及標準的殼蛋白免疫法的測定結(jié)果差異不顯著。因此，在測定帶有GFP標簽的病毒滴度時，GFP標記法是最為快速、有效且成本低廉的方法；不帶GFP標簽的病毒載體在不影響其他功能的情況下，最好能引入GFP標簽，可為后續(xù)試驗帶來便利。如本研究在構(gòu)建靶基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，引入GFP標簽構(gòu)建成融合蛋白表達載體，測定病毒滴度時即采用GFP標記法進行；另外，引入的GFP標簽也可為后續(xù)細胞模型和胚胎模型中的研究帶來直觀的結(jié)果。

本研究成功制備了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，為下一步在胚胎中進行相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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[9] LOGAN M， TABIN C. Targeted gene misexpression in chick limb buds using avian replication-competent retroviruses[J]. Methods， 1998， 14（4）： 407-420.

[10] THOMAS MA， LICHTENSTEIN DL， KRAJCSI P， et al. A real-time PCR method to rapidly titer adenovirus stocks[J]. Methods Mol Med， 2007， 130： 185-192.

[11] 孫鵬宇，張艷玲，荊玉明，等.腺病毒滴度不同測定方法比較[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31（2）：234-238.

[12] 鐘艷平，林若蕓，黎丹戎，等.HTERT重組第三代慢病毒載體的構(gòu)建及其病毒包裝鑒定[J].中國生物工程雜志，2011，31（9）：21-27.

[13] MAGALDI T G， BUCH M H， MURATA H， et al. Mutations in the GM1 binding site of simian virus 40 VP1 alter receptor usage and cell tropism[J]. J Virol， 2012， 86（13）： 7028-7042.

（責(zé)任編輯 程碧軍）

2 結(jié)果與分析

2.1 DF-1細胞的培養(yǎng)

DF-1細胞系解凍復(fù)蘇后傳代，待細胞生長穩(wěn)定后再進行轉(zhuǎn)染。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，解凍的細胞從圓形慢慢伸展開來變成纖維狀，如圖1所示，解凍后12 h有部分細胞已伸展開來，此時的死細胞較多，隨著細胞的增殖，到解凍后36 h細胞已長滿；傳代后的細胞生長良好，具有典型的成纖維細胞形態(tài)，傳代后24 h即鋪滿瓶底，可用于傳代。

2.2 病毒的包裝

在轉(zhuǎn)染后不同時間觀察細胞的生長狀態(tài)及綠色熒光蛋白的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞生長良好，轉(zhuǎn)染后2～4 d可見少許GFP陽性細胞的出現(xiàn)，之后GFP陽性細胞數(shù)量越來越多，熒光的亮度越來越強；轉(zhuǎn)染后7～8 d所有的細胞都有綠色熒光蛋白的表達；轉(zhuǎn)染后11 d左右，15 cm培養(yǎng)皿中的細胞已達到超匯合狀態(tài)，此時收集上清液即含有較多病毒顆粒；在高倍鏡下觀察細胞質(zhì)和細胞核中均有較強熒光信號（圖2）。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的測定

將濃縮的病毒液，從10-3到10-8逐級稀釋后感染DF-1細胞，48 h后觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，如圖3所示，10-3中大部分細胞為GFP陽性細胞，之后逐級減少，到10-8時僅有少數(shù)細胞有綠色熒光信號，計算病毒滴度為5×1010 IU/mL，達到病毒滴度≥108 IU/mL的要求。

3 討論

病毒滴度即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。病毒滴度的測定是病毒載體應(yīng)用過程中十分重要的步驟，為保證病毒具有較高的感染效率，須達到一定的滴度，如本研究所用的RCASBP病毒的滴度應(yīng)至少達到108 IU/mL，才能在禽類胚胎中迅速感染[9]。目前測定病毒滴度的方法有很多種，如細胞病變法、空斑法、OD260 nm法、殼蛋白免疫法、熒光定量PCR法和GFP標記法等[10-12]。其中細胞病變法和空斑法是最傳統(tǒng)的方法，操作耗時且穩(wěn)定性不好；OD260 nm法是測定病毒顆粒在260 nm處的吸光度，耗時短、成本低且穩(wěn)定，但不能區(qū)分感染性和缺陷性病毒顆粒，故應(yīng)用價值有限[11]；殼蛋白免疫法是最為標準、結(jié)果最為可靠的方法，但其對試劑的要求及成本較高；熒光定量PCR法是對病毒液中的完整病毒顆粒數(shù)進行精確的定量[13]，操作簡單、成本適中，但結(jié)果并不十分可靠，因為并非所有完整的病毒顆粒均具有感染力；GFP標記法是直接在顯微鏡下觀察GFP陽性細胞的數(shù)量，操作簡單、成本低、耗時短、穩(wěn)定性好，但只適用于帶有GFP標簽的病毒載體。孫鵬宇等[11]比較了上述幾種不同的測定方法，發(fā)現(xiàn)GFP標記法與傳統(tǒng)的細胞病變法及標準的殼蛋白免疫法的測定結(jié)果差異不顯著。因此，在測定帶有GFP標簽的病毒滴度時，GFP標記法是最為快速、有效且成本低廉的方法；不帶GFP標簽的病毒載體在不影響其他功能的情況下，最好能引入GFP標簽，可為后續(xù)試驗帶來便利。如本研究在構(gòu)建靶基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，引入GFP標簽構(gòu)建成融合蛋白表達載體，測定病毒滴度時即采用GFP標記法進行；另外，引入的GFP標簽也可為后續(xù)細胞模型和胚胎模型中的研究帶來直觀的結(jié)果。

本研究成功制備了高滴度的RCASBP-GFP-SMARCE1逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，為下一步在胚胎中進行相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] ISHII Y， REESE D E， MIKAWA T. Somatic transgenesis using retroviral vectors in the chicken embryo[J]. Dev Dyn， 2004， 229（3）： 630-642.

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（責(zé)任編輯 程碧軍）