鄧文　郭冬各　于翠　等

摘要：利用選擇性培養(yǎng)基，對不同施肥桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行分離、篩選，并采用Biolog自動微生物系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，分析不同施肥桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量和多樣性及土壤養(yǎng)分含量的變化。各施肥處理分離到的菌屬主要包括貪噬菌屬、氣單胞菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬和伯克氏菌屬等。施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥（TA）處理的土壤中解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)、Shannon-Wiene多樣性指數(shù)（H）和豐富度（S）均高于其他施肥處理。TA處理可提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀含量。相關(guān)性分析表明，TA處理土壤中解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量與土壤速效磷含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.66；空白（CK）處理的土壤中解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.62。

關(guān)鍵詞：施肥；桑樹；解有機(jī)磷細(xì)菌

中圖分類號：S888.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5383-04

桑樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，合理施肥對提高桑葉的產(chǎn)量和品質(zhì)十分重要[1，2]。在蠶桑生產(chǎn)中，主要通過施入化學(xué)磷肥補(bǔ)充桑樹對磷的需求，但是桑樹對磷肥的利用率很低，長期施用化學(xué)磷肥，一方面會導(dǎo)致大量磷素在桑園土壤中積累，造成磷資源的浪費(fèi)，另一方面引起桑園土壤中各種養(yǎng)分的失衡，最終將會影響桑樹的生長[3，4]。

植物根際解磷細(xì)菌不僅可以將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的可溶性磷，提高磷肥利用率，而且對植物生長起到一定程度的促生作用。林啟美等[5]報道，解磷細(xì)菌的數(shù)量受土壤類型、土壤肥力等的影響。吳凡等[6]對不同肥力條件下桑樹根際微生物的種群分析表明，肥沃土壤解磷細(xì)菌的數(shù)量和種類均高于貧瘠土壤。羅明等[7]發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥與N、P、K合理配施能有效促進(jìn)磷細(xì)菌的生長繁殖，提高其數(shù)量和活性。本試驗分析不同施肥對桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量和種群多樣性的影響，為通過合理施肥措施提高桑樹對磷的吸收利用及改善桑園土壤環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試桑樹

供試桑樹品種為湖桑32號，于1996年栽植于湖北省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所桑樹種質(zhì)資源圃，栽植密度為0.6 m × 1 m，低中干養(yǎng)成。

1.2 施肥處理

2009-2014年連續(xù)施肥試驗，每一種施肥處理小區(qū)按國家土壤肥力長期定位試驗標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一設(shè)置為66.7 m2。供試桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥是根據(jù)桑園土壤特點(diǎn)及桑樹對養(yǎng)分的基本需求研制而成，其中N、P2O5、K2O的比例為15∶4∶6，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。供試化肥為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀鎂（湖北宜化集團(tuán)有限責(zé)任公司）。

4種施肥處理的方式如下所述。①按照3 000 kg/hm2的施用量施用桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥（TA）；②施用與TA處理等氮的尿素，即450 kg/hm2氮素（TB）；③施用與TA處理等氮、磷、鉀的復(fù)合肥，即450 kg/hm2氮素、120 kg/hm2 P2O5、180 kg/hm2 K2O（TC）；④未施肥處理（CK）。每年分別于3月份和夏伐后施肥2次，每個施肥處理4次重復(fù)，隨機(jī)排列。

1.3 土樣采集

分別于2012年施肥前（3月12日），夏伐前大蠶用葉期（5月18日），新梢旺長期（7月4日），新梢緩慢生長期（9月7日），新梢停長期（11月8日）采集土壤樣品。每個處理隨機(jī)選取5個采樣點(diǎn)，除去表土，取桑樹根部1～4 mm松散粘附于根面的土壤，裝入自封袋，帶回實驗室。將5個采樣點(diǎn)的土樣混勻，一部分在4 ℃冰箱保存，用于解有機(jī)磷細(xì)菌分離，一部分自然風(fēng)干、過篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌的分離、計數(shù)

采用蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基進(jìn)行分離。每個土樣稱取5 g，放入盛有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，置于搖床上振蕩約20 min，取上清液以10倍稀釋法稀釋至10-4、10-5、10-6稀釋度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，統(tǒng)計具有溶磷圈的菌株數(shù)。解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行劃線純化后，進(jìn)行試管斜面培養(yǎng)用于鑒定。

1.5 桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌的多樣性測定

參照常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，在解磷細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基上觀察解有機(jī)磷細(xì)菌菌落特征，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對分離到的解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行初步分類[8，9]。使用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）、Pielou均勻度指數(shù)（J）和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）分析桑樹根際土壤解有機(jī)磷細(xì)菌的種群多樣性特征。多樣性指數(shù)的計算公式為H=-∑Pi㏑Pi，其中Pi=Ni/N，Ni為屬i單菌落的數(shù)量，N為土樣中總單菌落的數(shù)量；豐富度指數(shù)為屬i所在土樣中的數(shù)目；均勻度指數(shù)的計算公式為J=∑PilnPi/lnS；優(yōu)勢度指數(shù)的計算公式為D=∑Pi2。

1.6 解有機(jī)磷細(xì)菌的Biolog自動微生物系統(tǒng)鑒定

將分離到的解有機(jī)磷細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化和純化，挑取單菌落在BUG培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)，至長出單菌落，制備均勻的菌懸液，使用八通道移液器將菌懸液加入Biolog GN III鑒定板，置于33 ℃培養(yǎng)，在4～6 h和16～24 h分別進(jìn)行讀數(shù)。按可能性大?。⊿IM值）給出接近的種屬名稱，SIM值≥0.5為可接受的鑒定結(jié)果。

1.7 土壤基本理化性質(zhì)分析

有機(jī)質(zhì)含量測定采用重鉻酸鉀容量法，堿解氮含量測定采用堿解擴(kuò)散法，速效磷含量測定采用碳酸氫鈉浸提法，速效鉀含量測定采用火焰光度法[10]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS v7.05版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，Excel軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥對桑樹根際土壤養(yǎng)分含量的影響

如表1所示，各取樣時期TA處理土壤有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效鉀含量均高于TB、TC及CK，且有機(jī)質(zhì)和速效鉀含量差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。TA和TB處理土壤速效磷含量高于TC、CK，且差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。說明桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用可以提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀的積累。

2.2 施肥對桑樹根際土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量的影響

如圖1所示，土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量全年表現(xiàn)先升高后下降的趨勢，各處理土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量均在5月18日達(dá)到最高值。TA處理在全年各取樣時期解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量高于其他處理（除5月18日外），且差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。表明桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用能夠更有效地提高桑園土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量。

2.3 不同施肥桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)

由表2可知，不同施肥處理桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌以革蘭氏陰性菌為主，分別屬于貪噬菌屬、氣單胞菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬和產(chǎn)堿菌屬等。與其他3種處理相比，TA處理種群結(jié)構(gòu)豐富，可能是有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用使得土壤有機(jī)物質(zhì)含量豐富，從而有利于不同種類解有機(jī)磷細(xì)菌的生長繁殖。

2.4 施肥對桑樹根際土壤解有機(jī)磷細(xì)菌種群多樣性的影響

由表3可知，TA處理土壤解有機(jī)磷細(xì)菌種群多樣性指數(shù)（H）和豐富度指數(shù)（S）均最高，而均勻度指數(shù)（J）較低，可能是由于存在爭論貪噬菌和伯克氏菌屬的優(yōu)勢菌群所致。因此，桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用能夠提高桑園土壤解有機(jī)磷細(xì)菌的種群多樣性。

2.5 解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

由表4可知，TA處理土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量與土壤速效磷含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.66；CK處理土壤解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.62。說明施用桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥后土壤中速效磷含量提高，桑樹根際解有機(jī)磷細(xì)菌分布也增加。

3 小結(jié)與討論

3.1 施肥與桑樹根際土壤養(yǎng)分狀況

土壤有機(jī)質(zhì)包括各種動植物殘體以及微生物及其生命活動所產(chǎn)生的各種有機(jī)物[11]，它一方面為植物的生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)元素，另一方面對形成土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤物理性狀，調(diào)節(jié)土壤水分、空氣、溫度有重要的作用。已有研究表明，有機(jī)肥配施化肥能明顯提高土壤活性有機(jī)質(zhì)和總有機(jī)質(zhì)的含量，使用有機(jī)肥料還能減少土壤対磷的固定，提高磷肥的有效性和利用率[12-15]。本試驗結(jié)果表明，TA處理有機(jī)質(zhì)含量值高于TC、TD處理及CK，這說明施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥更有利于桑園土壤中有機(jī)質(zhì)積累，而TB和TC處理土壤有機(jī)質(zhì)含量變化差異較小，其原因有待連續(xù)多年深入研究。

土壤速效養(yǎng)分可被植物直接吸收利用，或在短期內(nèi)能轉(zhuǎn)化為植物可吸收的養(yǎng)分，其含量是反應(yīng)土壤養(yǎng)分供應(yīng)能力的重要指標(biāo)。已有研究表明，有機(jī)-無機(jī)肥料能夠減弱無機(jī)氮對土壤的酸化作用，提高土壤中速效氮、速效磷和速效鉀的含量，進(jìn)而提高土壤速效養(yǎng)分的供給能力[16-20]。本試驗結(jié)果表明，施用3 000 kg/hm2桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥可以提高土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量，原因可能是有機(jī)肥能夠減弱土壤礦物粘粒對磷的固定，同時有機(jī)肥含有的腐植酸的官能團(tuán)與鉀離子結(jié)合，從而提高土壤的供磷能力和供鉀能力。

3.2 施肥與桑樹根際土壤解磷細(xì)菌數(shù)量及其種群結(jié)構(gòu)

植物生長所必需的磷主要從土壤磷庫獲得，但施入的磷肥迅速轉(zhuǎn)化為難以直接吸收利用的遲效態(tài)磷，影響磷素利用率的關(guān)鍵問題是其在土壤中的有效性，土壤中解磷細(xì)菌的數(shù)量、種類和活性標(biāo)志著土壤難溶性磷轉(zhuǎn)化和可被植物利用的狀況[21，22]。Luo等[23]研究表明，與化肥相比，施用有機(jī)肥能夠增加溶磷菌的數(shù)量。范丙全等[24]發(fā)現(xiàn)NPK、NPK+綠肥的施用都使土壤中解磷微生物數(shù)量降低、種類減少，可能是油菜產(chǎn)生的某些物質(zhì)對溶磷細(xì)菌有殺死或抑制作用。本試驗結(jié)果表明，3 000 kg/hm2桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用可提高土壤解有機(jī)磷細(xì)菌的種群多樣性。因此，桑樹專用有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥的施用不僅對維持土壤中各種養(yǎng)分的平衡有重要的作用，也為土壤中解磷微生物提供了有利的生長環(huán)境，而不同施肥處理對土壤解磷細(xì)菌的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯 彭西甜）

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（責(zé)任編輯 彭西甜）

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（責(zé)任編輯 彭西甜）