李艷云，張艷英，史秋梅，趙惠媛，王曉珊，盧會(huì)鵬 (河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北昌黎 066600)

紫錐菊多糖對(duì)LPS損傷后IEC-6細(xì)胞的增殖作用

李艷云，張艷英，史秋梅*，趙惠媛，王曉珊，盧會(huì)鵬 (河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北昌黎 066600)

[目的]為了研究紫錐菊多糖對(duì)LPS損傷后小腸上皮細(xì)胞株IEC-6細(xì)胞增殖的影響。[方法]以IEC-6細(xì)胞為研究對(duì)象，將LPS 10 μg/ml分別與EPS 50、100、200、500 μg/ml先后加入培養(yǎng)液，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，觀察紫錐菊多糖對(duì)該細(xì)胞增殖的影響。[結(jié)果]紫錐菊多糖100、500 μg/ml對(duì)LPS損傷后的IEC-6細(xì)胞分別在48、72 h具有促增殖作用，因此紫錐菊多糖對(duì)LPS損傷后的IEC-6細(xì)胞具有保護(hù)作用。[結(jié)論]紫錐菊多糖預(yù)處理能增強(qiáng)LPS損傷后IEC-6細(xì)胞的增殖活性，能降低LPS對(duì)IEC-6細(xì)胞的損傷而顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

隱窩細(xì)胞；細(xì)胞增殖；脂多糖

紫錐菊(Echinaceapurpurea)是原產(chǎn)于美洲的一類(lèi)菊科野生花卉，是世界聞名的“免疫”草藥[1]。紫錐菊含有紫錐菊甙、多糖、菊苣酸等多種活性成分[2]，能刺激巨噬細(xì)胞的吞噬功能，使T淋巴細(xì)胞增殖，顯著增強(qiáng)體液免疫功能，具有干擾素樣作用，抑制病毒生長(zhǎng)[3]。LPS是革蘭氏陰性桿菌生長(zhǎng)或死亡時(shí)裂解出來(lái)的細(xì)胞壁脂多糖成分，經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞因子釋放的“級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)”引發(fā)多器官功能衰竭，甚至機(jī)體死亡[4-5]。小腸上皮隱窩細(xì)胞(IEC)在消化中不僅起吸收和交換營(yíng)養(yǎng)的作用，而且是腸黏膜屏障的重要組成部分。它在宿主黏膜表面的天然及獲得性免疫系統(tǒng)中起調(diào)節(jié)作用，是對(duì)抗腸道細(xì)菌、毒素的第一道防線[6-8]。而小腸上皮細(xì)胞的增殖是腸道黏膜病理性損傷后修復(fù)，從而重建上皮完整性和維護(hù)黏膜屏障的關(guān)鍵[9-10]。

選擇大鼠小腸黏膜隱窩細(xì)胞株IEC-6為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)LPS作用于IEC-6細(xì)胞上造成體外炎癥性腸損傷模型，以觀察紫錐菊對(duì)IEC-6細(xì)胞的增殖作用為目標(biāo)進(jìn)行活性追蹤，從而明確紫錐菊對(duì)小腸黏膜修復(fù)的作用特點(diǎn)，闡明紫錐菊對(duì)腸黏膜修復(fù)作用的生物學(xué)機(jī)制，為藥物治療疾病提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料供試紫錐菊多糖EPS購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，多糖類(lèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于94%；IEC-6細(xì)胞株購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS：E.ColiO55：B5，貨號(hào)L6529，Sigma產(chǎn)品)購(gòu)于上海前塵生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，胎牛血清，胰島素，噻唑藍(lán)(MTT)：Sigma 公司產(chǎn)品；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。

完全培養(yǎng)液(cDMEM)由濃度90%DMEM、濃度10%進(jìn)口胎牛血清、0.01 mg/ml胰島素組成；MTT溶液的制備方法為：取MTT 250 mg，37 ℃水浴中溶于50 ml 0.01 mmol/L pH 7.4的PBS中，濃度為5 mg/ml，過(guò)濾除菌分裝，凍存；LPS溶液的制備方法為：取LPS適量，分別用PBS稀釋至5、10、20 μg/ml，凍存；紫錐菊多糖溶液用蒸餾水稀釋至50、100、200、500 μg/ml，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)。IEC-6細(xì)胞株用濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，配以0.01 mg/ml胰島素，在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為六大組：A組空白對(duì)照組，以DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照；B組單純LPS組，LPS濃度為10 μg/ml；C組單純EPS組，分為四亞組，即①EPS 50 μg/ml，②EPS 100 μg/ml，③EPS 200 μg/ml，④EPS 500 μg/ml；D組LPS與不同濃度EPS組，分為四亞組，即①LPS 10 μg/ml+EPS 50 μg/ml組，②LPS 10 μg/ml+EPS 100 μg/ml組，③ LPS 10 μg/ml+EPS 200 μg/ml組，④LPS 10 μg/ml+EPS 500 μg/ml組；E組EPS預(yù)處理與不同濃度LPS組，分為三亞組，即①EPS 500 μg/ml+LPS 5 μg/ml組，②EPS 500 μg/ml+LPS 10 μg/ml組，③ EPS 500 μg/ml+LPS 20 μg/ml組。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3EPS對(duì)正常IEC-6細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；用濃度0.25%胰酶加上濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細(xì)胞；用細(xì)胞記數(shù)板準(zhǔn)確記數(shù)，以每孔1×104/200 μl密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入不同濃度的EPS 100 μl，使其終濃度分別為50、100、200、500 μg/ml，空白對(duì)照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24、48、72 h；培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h；1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入DMSO 150 μl，作用5 min，微振蕩，490 nm波長(zhǎng)上測(cè)定每孔OD值；最后，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率=[1-(對(duì)照組OD-試驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD]×100%

1.2.4EPS對(duì)LPS作用下IEC-6細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；用濃度0.25%胰酶加上濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細(xì)胞；用細(xì)胞記數(shù)板準(zhǔn)確記數(shù)，以每孔1×104/200 μl的密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入10 μg/ml濃度的LPS 100 μl，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培育1 h；取出后，再加入不同濃度的EPS 100 μl，使其最終濃度分別為50、100、200、500 μg/ml，對(duì)照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中分別培育24、48、72 h；培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，MTT處理方法步驟同“1.2.3”；最后，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.5EPS預(yù)處理對(duì)LPS作用下IEC-6細(xì)胞增殖的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；用濃度0.25%胰酶和濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細(xì)胞；用細(xì)胞記數(shù)板準(zhǔn)確記數(shù)，以每孔1×104/200 μl密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入500 μg/ml濃度的EPS100 μl預(yù)處理24 h；然后，給予LPS，使其終濃度分別為5、10、20 μg/ml，對(duì)照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培育1 h；培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，MTT處理方法同步驟“1.2.3”；最后，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常及LPS損傷后小腸上皮細(xì)胞形態(tài)觀察正常小腸上皮細(xì)胞株由均勻的上皮樣細(xì)胞群體組成，呈鋪路石鑲嵌排列，互不重疊，為典型單層，細(xì)胞為不規(guī)則多角形，邊界清楚，細(xì)胞核較大，呈現(xiàn)卵圓形，細(xì)胞間相互連接，呈現(xiàn)旺盛的增殖性(圖1)。LPS損傷的小腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒樣物質(zhì)，部分細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞形態(tài)不完整(圖2～4)。

2.2 EPS對(duì)正常培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞增殖作用的影響EPS在不同時(shí)間段對(duì)正常培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞增殖作用不同。不同濃度的EPS對(duì)細(xì)胞的增殖作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。由表1、圖5可知，EPS對(duì)IEC-6細(xì)胞呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性促增殖作用，但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度的促增殖效果也不盡相同，表現(xiàn)為第24小時(shí)200 μg/ml EPS有顯著促增殖作用，而在第72小時(shí)EPS濃度為100 μg/ml時(shí)才表現(xiàn)出顯著的促增殖效應(yīng)?？傮w來(lái)講，200 μg/ml濃度的EPS效果最佳，見(jiàn)表1、表2、圖5。

2.3 EPS對(duì)LPS損傷后IEC-6細(xì)胞增殖作用的影響IEC-6細(xì)胞受LPS(10 μg/ml)作用1 h后，在培養(yǎng)體系中加入不同濃度的EPS，觀察EPS對(duì)LPS損傷后IEC-6細(xì)胞是否仍有促增殖作用。由表2、圖6可知，受LPS作用的細(xì)胞，EPS濃度為50 μg/ml時(shí)作用24 h的效果最好，EPS濃度為100 μg/ml時(shí)作用48 h效果最好，而EPS濃度為500 μg/ml時(shí)作用在72 h達(dá)到最佳效果。

表1 EPS對(duì)正常培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞增殖活性的影響

表2 EPS對(duì)LPS作用下的IEC-6細(xì)胞增殖活性的影響

2.4 EPS預(yù)處理對(duì)LPS損傷的IEC-6細(xì)胞增殖作用的影響將培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞用500 μg/ml EPS預(yù)處理24 h，然后加不同濃度的LPS(分別為5、10、20 μg/ml)，觀察1 h，測(cè)定細(xì)胞增殖活性。由表3、圖7可知，EPS預(yù)處理后對(duì)LPS有顯著的促增殖作用。當(dāng)受到5 μg/ml LPS作用時(shí)，與對(duì)照組相比，EPS預(yù)處理組沒(méi)有顯著的促增殖作用。但是，當(dāng)受到10、20 μg/ml LPS作用時(shí)，與對(duì)照組相比，EPS預(yù)處理組有0.05水平顯著的促增殖作用。

表3 EPS預(yù)處理后LPS作用下的IEC-6細(xì)胞的增殖活性

3 結(jié)論與討論

小腸上皮隱窩細(xì)胞是腸道內(nèi)重要的功能細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，并與腸道的內(nèi)、外分泌功能有密切關(guān)系。腸道黏膜損傷后的修復(fù)主要依靠隱窩細(xì)胞的不斷增殖、分化，從而重建腸屏障功能。因此，研究腸上皮隱窩細(xì)胞的增殖對(duì)于修復(fù)腸黏膜損傷具有重要意義。研究表明，紫錐菊多糖對(duì)正常IEC-6細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。研究進(jìn)一步顯示，對(duì)于受LPS損傷的小腸上皮細(xì)胞，當(dāng)向培養(yǎng)體系中加入不同濃度的紫錐菊多糖時(shí)，在不同時(shí)間段、不同濃度均有促增殖作用。試驗(yàn)還顯示，紫錐菊多糖預(yù)處理能增強(qiáng)LPS損傷后IEC-6細(xì)胞的增殖活性，能降低LPS對(duì)IEC-6細(xì)胞的損傷而顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。這一作用在LPS 5 μg/ml小劑量時(shí)不明顯，而在劑量為10、20 μg/ml時(shí)有明顯的作用。這提示紫錐菊多糖的治療效果也取決于LPS對(duì)IEC-6細(xì)胞的損傷程度。小劑量LPS對(duì)腸道上皮的損傷較小，影響細(xì)胞的增殖功能不明顯，隨著LPS劑量的增大，對(duì)IEC-6細(xì)胞的損傷也增強(qiáng)，此時(shí)紫錐菊多糖的促增殖效果明顯顯現(xiàn)。試驗(yàn)證明，紫錐菊多糖有促進(jìn)腸黏膜上皮損傷修復(fù)的潛能。這從腸黏膜理化損傷修復(fù)角度說(shuō)明預(yù)防性應(yīng)用紫錐菊多糖在治療內(nèi)毒素血癥引起的胃腸功能障礙中對(duì)減輕腸道損傷具有一定的應(yīng)用價(jià)值

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The Multiplication Effect ofEchinaceapurpureaPolysaccharide on IEC-6 Cell after LPS Injury

LI Yan-yun, ZHANG Yan-ying, SHI Qiu-mei*et al

(Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Hebei Normal University of Science and Technology, Changli, Hebei 066600)

[Objective] To study effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on intestinal epithelial cell line IEC-6 cells multiplication after LPS damaged. [Method] To observe the effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on the cell multiplication, using IEC-6 cell as the research object, adding LPS 10 μg/ml into medium with EPS 50, 100, 200, 500 μg/ml, the rate of cell multiplication was detected by MTT method. [Result] The concentration ofEchinaceapurpureapolysaccharide at 100 and 500 μg/ml could promote proliferation on IEC-6 cells after LPS damaged in 48 and 72 h. So,Echinaceapurpureapolysaccharide had a protective effect on IEC-6 cells that LPS injured. [Conclusion]Echinaceapurpureapolysaccharide pretreatment can enhance the proliferation activity of IEC-6 cells and reduce the damage of IEC-6 cells after LPS injured, and show protective effect on cells.

Crypt cell; Cell multiplication; Lipopolysaccharide

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31472230)；河北省自然基金項(xiàng)目(C2014407068)；河北省科技支撐計(jì)劃(14966610D、12220408D)；石家莊市科技支撐計(jì)劃(131200063A)；河北省教育廳百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(Ⅱ)、ZH2011244、Q2012037。

李艷云(1986- )，女，河南上蔡人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物病原微生物與動(dòng)物傳染病。*通訊作者，教授，從事動(dòng)物傳染病學(xué)方面的研究。

2015-03-27

S 852.6

A

0517-6611(2015)14-019-03