叢國強(qiáng), 尹成林, 何邦令, 李 玲, 高克祥

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 泰安 271000

水分脅迫下內(nèi)生真菌球毛殼ND35對冬小麥苗期生長和抗旱性的影響

叢國強(qiáng), 尹成林, 何邦令, 李 玲, 高克祥*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 泰安 271000

為明確不同水分條件下內(nèi)生真菌對冬小麥苗期生長和抗旱性的影響，以抗旱型小麥品種山農(nóng)16和水分敏感型小麥品種山農(nóng)22為材料，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測小麥干旱誘導(dǎo)基因脫水素wzy2的表達(dá)量來了解冬小麥在干旱脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)差異，通過測定相關(guān)生理指標(biāo)與酶活性來判斷小麥發(fā)育及其在干旱脅迫下的生理響應(yīng)狀況。結(jié)果表明，與正常水分ND35組相比，接種球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)ND35的干旱處理組小麥的根冠比、總蛋白含量、脯氨酸含量及丙二醛含量等指標(biāo)顯著提高，小麥葉片含水量和可溶性糖含量有所降低。在干旱處理組中，球毛殼菌ND35可以顯著提高小麥山農(nóng)16的根長和山農(nóng)22的株高，接種球毛殼ND35的山農(nóng)16脯氨酸含量、可溶性糖含量、過氧化氫酶活性比對照組均顯著提高，丙二醛含量比對照組降低9.0%，但差異不顯著；山農(nóng)22脯氨酸含量和過氧化氫酶活性比對照組顯著提高，丙二醛含量和可溶性糖含量比對照組有所降低，但可溶性糖含量差異不顯著；相對定量檢測數(shù)據(jù)顯示，接種球毛殼ND35后，兩種小麥脫水素wzy2基因的表達(dá)量較對照組均能夠顯著提高。綜合分析說明內(nèi)生真菌球毛殼ND35可以促進(jìn)冬小麥苗期根系和植株發(fā)育，小麥提前進(jìn)入三葉期，增強(qiáng)小麥避旱性，同時提高小麥根系活力，增強(qiáng)小麥耐旱性；提高個體細(xì)胞內(nèi)水分、糖分、脯氨酸含量，降低丙二醛的氧化性損傷，增強(qiáng)過氧化氫酶活性，從而提高兩種冬小麥對干旱脅迫的耐受能力；球毛殼ND35促進(jìn)小麥干旱誘導(dǎo)相關(guān)基因wzy2 的表達(dá)量，進(jìn)而提高抗旱相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而提高兩種冬小麥耐脫水性和對干旱脅迫的適應(yīng)性。

小麥; 苗期生長; 內(nèi)生真菌; 球毛殼ND35; 水分脅迫; 脫水素基因表達(dá)

由于淡水資源匱乏和地理分布不均，干旱條件成為植物最常見的逆境條件，也成為制約糧食產(chǎn)量的世界性難題。因此，減輕干旱脅迫對小麥生產(chǎn)的損失成為農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的熱點(diǎn)?？蒲泄ぷ髡邚膬?nèi)生真菌與植物、土壤等生理生態(tài)現(xiàn)象的觀察和描述，深入到內(nèi)生真菌與植物、環(huán)境之間作用機(jī)理及其互作影響的研究，并取得突破性進(jìn)展。例如，內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisorchidophila)能明顯提高土壤中纖維素酶和木質(zhì)素酶活性，加快凋落物纖維素和木質(zhì)素的降解，協(xié)同土壤中的土著微生物群落改善土壤環(huán)境，促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)[1]。內(nèi)生真菌對多年生黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festucaarundinacea)等禾草植物抗旱性影響的研究也表明[2-3]，內(nèi)生真菌可以通過促進(jìn)宿主植物根系發(fā)育、葉片生長、氣孔開閉、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化保護(hù)系統(tǒng)等一系列生理生化反應(yīng)誘導(dǎo)植物提高對干旱脅迫的抗性[4-6]。但有關(guān)內(nèi)生真菌與植物干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)及其影響植物干旱脅迫適應(yīng)性的研究相對較少。

球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)ND35菌株作為一個分離于健康毛白楊(Populustomentosa)的內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌株。已有報道證明，球毛殼菌 ND35菌株能夠促進(jìn)植株生長、提高防御酶活性[7-10]。脫水素(Dehydrin)是一種廣泛存在于高等植物的干旱誘導(dǎo)蛋白。已有研究表明，植物的抗旱與脫水素的表達(dá)量之間有一定的關(guān)系[11]，wzy2是從小麥中克隆出來的一種脫水素基因，并已成功構(gòu)建和應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR方法。而且，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種特異性強(qiáng)、高敏感性的定量檢測基因表達(dá)的有效方法，此方法在微生物的檢測、基因表達(dá)研究等方面具有重要的應(yīng)用價值[12]。本試驗(yàn)采用控制水分質(zhì)量法模擬不同水分條件，接種內(nèi)生真菌球毛殼菌ND35，通過測定不同水分條件下小麥植株的形態(tài)生理生化指標(biāo)來明確小麥對干旱脅迫下的生理響應(yīng)，并在分子水平檢測內(nèi)生真菌影響小麥干旱誘導(dǎo)基因wzy2的表達(dá)差異。綜合探討分析內(nèi)生真菌球毛殼菌ND35對冬小麥植株生長及其對小麥干旱適應(yīng)性的影響。旨在探討內(nèi)生真菌對于促進(jìn)禾谷類作物植株生長，提高其干旱適應(yīng)性的作用機(jī)制，同時為發(fā)掘有益生物資源和推進(jìn)植物內(nèi)生菌在宿主體外的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2012年10月—2013年7月在山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試小麥品種為抗旱型的山農(nóng)16[13]和水分敏感型的山農(nóng)22，栽培基質(zhì)為過30 目篩的沙土。栽培沙土pH值 7.19，有機(jī)質(zhì)0.46 g/kg，全氮含量0.12 g/kg，全磷含量0.15 g/kg，全鉀含量16 g/kg，速效氮11 mg/kg，速效磷24 mg/kg，速效鉀為46 mg/kg。種植盆規(guī)格30 cm×20 cm×6 cm，每盆裝滅菌的沙土2.5 kg，干旱處理盆中營養(yǎng)液比重占土壤最大持水量的30%(栽培沙土總質(zhì)量2.66 kg)，常規(guī)處理盆中營養(yǎng)液比重占土壤最大持水量的60%(栽培沙土總質(zhì)量2.84 kg)，充分混勻準(zhǔn)備進(jìn)行小麥苗期培養(yǎng)。營養(yǎng)液根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]改進(jìn)了配方濃度(表1)。

表1 營養(yǎng)液配方濃度

供試真菌為球毛殼菌ND35菌株，其孢子粉制備方法：將平板培養(yǎng)好已經(jīng)產(chǎn)孢的球毛殼菌ND35菌株配制成濃度為1.0×106cfu/mL的孢子懸浮液，按10 mL/kg的劑量接種到事先滅菌熟化處理過的麥粒上，在25 ℃下培養(yǎng)15—20 d，晾干后粉碎麥粒得到孢子粉。

采用血球計數(shù)板計數(shù)孢子含量。取制備好的孢子粉1.0 g，加入100 mL無菌水加以稀釋，將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板計數(shù)室上面，用細(xì)口滴管吸取少量充分振蕩混勻的菌液，加1滴在蓋玻片上，讓菌液由蓋玻片與計數(shù)板的縫隙間滲入計數(shù)室，靜置片刻，待孢子自然沉降并穩(wěn)定后開始計數(shù)，每次計數(shù)做3個重復(fù)，取平均值。

1.2 試驗(yàn)方案

將小麥種子在20 ℃保濕催芽后，選擇發(fā)芽勢均勻一致的種子播種于沙土層下1 cm。在種子表面施加濃度為5500 cfu/g的孢子粉0.3 g/粒種子。株距×行距=2 cm×2 cm，共設(shè)4個處理：(1)干旱+CK；(2)干旱+ND35；(3)正常+CK；(4)正常+ND35。每個試驗(yàn)處理150株，種植完逐個種植盆編號稱重并記錄。

水分管理：所有處理組按控制質(zhì)量法進(jìn)行管理，每天逐個稱重干旱處理組和正常水分處理組中的花盆，加水至與播種時記錄的重量恒重，澆水時間在清晨和日落后1 h完成。試驗(yàn)重復(fù)兩次，第1次于2012年10月17日播種，11月22日采樣；第2次于2013年3月7日播種，4月12日采樣，室溫培養(yǎng)35 d，期間觀察小麥生長狀況，保存樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)檢測，其中每個處理取10株小麥液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 小麥苗高、根長及相對含水量的測定

將各處理小麥地上部苗高(cm)和地下部根長(cm)分別編號測量記錄，以30 株為1組稱量鮮重(g)并編號記錄，將小麥植株在105 ℃下殺青1 h，然后在70 ℃下烘干至恒重，稱量每組小麥干重(g)、小麥地上部干重(g)和根干重(g)，計算小麥鮮重含水量(%)和根冠比。計算公式如下：

根冠比=根干重(g)/地上部干重(g)；鮮重含水量(%)= [(Wf-Wd)/Wf]×100%

式中，Wf為鮮重(g)；Wd為干重(g)。

1.3.2 小麥生理學(xué)特性指標(biāo)的測定

以下生理學(xué)特性指標(biāo)測定均參照王學(xué)奎《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》[14]中的方法。

(1)小麥根系活力測定 采用TTC法，取不同處理小麥根尖0.3 g，放入10 mL燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液(1/15 mol/L，pH值 7)各5 mL，37 ℃下暗保溫1 h，此后加入1 mol/L硫酸 2 mL，終止反應(yīng)。將根取出，吸干水分，加入乙酸乙酯4 mL，一起在研缽內(nèi)磨碎以提取甲腙，最后加乙酸乙酯定容到10 mL，于分光光度計485 nm波長下測定。

(2)游離脯氨酸含量的測定 采用酸性茚三酮法，取不同處理的新鮮小麥葉片0.5 g放入具塞試管，加3%磺基水楊酸5 mL，沸水浴中提取10 min。吸取濾液2 mL加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮，沸水浴顯色30 min。冷卻后用甲苯萃取，于分光光度計520 nm波長下比色測定。

(3)小麥葉片總蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法，取不同處理的新鮮小麥葉片1.0 g放入研缽，加2 mL蒸餾水研磨勻漿，再用5 mL蒸餾水清洗，轉(zhuǎn)移至離心管，25 ℃下放置1 h，然后在4000 r/min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶定容。吸取蛋白質(zhì)提取液0.1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán) G-250 蛋白試劑，放置2 min后在595 nm波長下比色測定。

(4)可溶性糖含量測定 采用苯酚法，取不同處理的小麥葉片0.3 g放入刻度試管，加入5—10 mL蒸餾水，封口后置沸水浴30 min(提取2次)，冷卻后過濾并定容到25 mL容量瓶。吸取待測液0.5 mL加1.5 mL蒸餾水，按順序加1 mL 9%苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，在室溫下放置30 min，在485 nm波長下比色測定。

(5)丙二醛(MDA)含量測定 采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid, TBA)法，取不同處理的小麥葉片0.5 g，加入5%三氯乙酸(TCA)5 mL，研磨后所得勻漿在 3000 r/min下離心10 min。取上清液2 mL，加2 mL 0.67% TBA，混合后在100 ℃水浴鍋上煮沸30 min，冷卻后離心，分別取上清液在450 nm、532 nm和600 nm處測定吸光度。

(6)過氧化氫酶(CAT)活性測定 采用紫外吸收法，取不同處理的小麥葉片0.5 g，加入3 mL 4 ℃下預(yù)冷的pH值 7.8的磷酸緩沖液少量，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶定容，混合均勻后將容量瓶置5℃冰箱中10 min，取上部清液于4000 r/min下離心15 min，上清液即為過氧化氫粗提液。取0.2 mL粗酶液，加入pH值 7.8的磷酸緩沖液1.5 mL和蒸餾水1.0 mL，混合置于25 ℃下預(yù)熱，逐管加入0.1 mol/L的H2O20.3 mL，立即計時，并迅速倒入比色皿中，在240 nm下測定吸光度，間隔1 min中讀數(shù)1次，共測定4 min，計算酶活性。

1.3.3 小麥脫水素基因wzy2表達(dá)差異相對定量檢測

(1)總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄的合成

總RNA提取按照Trizol試劑(TransGen)說明書進(jìn)行，從總RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。具體方法按照Fast Quant RT Kit (With gDNase) 進(jìn)行：在經(jīng)DEPC處理過的PCR管中加入總RNA 1 μg，5× g DNA buffer 2 μL，10× Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，加入DEPC處理的滅菌水至20 μL體系，混合均勻后，置于42 ℃反轉(zhuǎn)錄孵育反應(yīng)15 min，95 ℃孵育反應(yīng)3 min，以消除轉(zhuǎn)錄酶的活性，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA貯存于-80℃冰箱。

(2)小麥脫水素基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和目的基因的定量

實(shí)時定量PCR采用Tiangen公司SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒。25 μL反應(yīng)體系包含SuperReal PreMix Plus (2×) 12.5 μL，濃度為10 mmol/L的上、下游引物各0.75 μL，cDNA 2 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。反應(yīng)于Bio-Rad PCR儀(型號i QTM5)上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增，每個樣品做3次平行反應(yīng)，采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40次。結(jié)束后進(jìn)行65—95 ℃融解曲線分析，熒光波長為490 nm。

在樣品定量PCR擴(kuò)增的同時，將cDNA樣品稀釋至原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4及10-5，形成5個濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品。采用同樣的方法分別以這5個不同的濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各cDNA樣品分別以目標(biāo)基因wzy2引物和內(nèi)參基因β-actin引物進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物序列設(shè)計參考文獻(xiàn)[15]，對退火溫度做了調(diào)整，由 生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如表2所示。

表2 脫水素基因 wzy2序列及內(nèi)參基因肌動蛋白基因 β-actin引物

(3)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析方法

用相對定量方法分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)擴(kuò)增曲線，在Excel軟件上進(jìn)行相對定量研究和統(tǒng)計分析，確定每個基因在反應(yīng)管中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)。以β-actin為對照基因，校正PCR模板的拷貝數(shù)。相對定量采用2-ΔΔCt方法計算[16]，即相對倍數(shù)(relative quantification)=2-ΔΔCt sample。具體計算公式：

ΔCtsample=Ctsample-Ctactin

ΔΔCtsample= 處理組(ΔCtsample)-對照組(ΔCtsample)

式中，Ct為每個PCR反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；Ctsample為樣品中wzy2基因的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；Ctactin為樣品中β-actin基因的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用 Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用 LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 球毛殼菌ND35對小麥苗期生長及相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常水分管理相比，水分脅迫處理使兩種小麥苗期苗高、根長均減小，但根冠比明顯提高，差異達(dá)到顯著水平。干旱處理組中，接種球毛殼菌ND35的抗旱型小麥山農(nóng)16的苗高、根長、根冠比及總蛋白含量分別比對照組提高4.0%、17.5%、7.7%和16.0%，其中根長，根冠比及總蛋白量差異達(dá)到顯著水平；干旱條件下，接種球毛殼菌ND35的水分敏感型小麥山農(nóng)22的苗高、根長、總蛋白量差異均達(dá)到顯著水平，分別比對照組提高15.2%、6.9%、43.2%(表3)，根冠比差異未達(dá)到顯著水平。說明在干旱脅迫條件下，接種球毛殼菌ND35能夠促進(jìn)抗旱型小麥的根系發(fā)育，促進(jìn)水分敏感型小麥的植株生長，均能增加兩種小麥的植株蛋白質(zhì)含量。在正常水分條件下，接種球毛殼菌ND35也能夠明顯提高兩種小麥的根系活力。

表3 不同水分條件下，球毛殼菌ND35對不同小麥品種苗高、根長、根冠比、根系活力和蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 球毛殼菌ND35對小麥抗旱相關(guān)生理指標(biāo)的影響

與正常水分管理相比，干旱條件下的小麥葉片中脯氨酸和丙二醛含量明顯增多，差異達(dá)到極顯著性水平(P<0.01)，而可溶性糖和葉片含水量明顯降低。在干旱處理組中，球毛殼菌ND35處理的兩種小麥脯氨酸含量和葉片含水量與對照組相比均達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，而山農(nóng)16丙二醛含量與對照相比差異不顯著。接種球毛殼菌ND35的山農(nóng)16的脯氨酸含量、葉片含水量和過氧化氫酶活性分別比對照組提高40.7%、2.7%和124.47%，山農(nóng)22分別提高46.4%、2.7%和23.02%，而山農(nóng)16的葉片丙二醛含量相對于對照組降低9.0%，山農(nóng)22的葉片丙二醛含量降低43.0%。而在正常水分條件下，兩種小麥葉片的脯氨酸含量、丙二醛含量及葉片含水量分別與對照組相比差異不顯著(表4)。以上結(jié)果表明，干旱脅迫條件下，接種球毛殼菌ND35的小麥滲透勢比對照組有所提高，葉片含水量相對增加，丙二醛含量降低則說明接種ND35的兩種小麥對干旱逆境的過氧化傷害程度降低。

表4 不同水分條件下，球毛殼ND35對不同小麥品種可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、葉片含水量和過氧化氫酶活性的影響

2.3 wzy2基因表達(dá)差異相對定量分析

2.3.1 wzy2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 脫水素基因wzy2的定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of wzy2 quantitative PCR

圖2 脫水素基因wzy2的目的片段融解曲線的單峰圖Fig.2 The single peak melting curve graph of the wzy2

如圖1所示，試驗(yàn)建立的目的基因wzy2的標(biāo)準(zhǔn)曲線是cDNA濃度梯度的lg值對Ct值作圖，其相關(guān)系數(shù)為0.996，接近于1，相關(guān)性很好，基本符合相對定量2-ΔΔCt對樣品的要求。

圖3 脫水素基因wzy2的目的片段熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖 Fig.3 The fluorescence quantitative PCR curve of the amplification fragment of wzy2

2.3.2 引物特異性檢驗(yàn)及擴(kuò)增曲線

從圖2、圖3可以看出，定量PCR鑒定的目的基因擴(kuò)增條件、引物設(shè)計均符合要求，PCR的產(chǎn)物特異性強(qiáng)，無非特異性片段產(chǎn)生。

2.3.3 干旱條件下，球毛殼菌ND35對苗期不同敏感型小麥脫水素表達(dá)量的影響

按照相對定量 2-ΔΔCt方法對山農(nóng)16，山農(nóng)22小麥脫水素基因PCR結(jié)果轉(zhuǎn)化成表達(dá)量，為了直觀，將測定的數(shù)據(jù)制作成柱狀圖，結(jié)果如圖4所示。

從圖4 RT-PCR結(jié)果可以看出，30%土壤相對含水量條件下，ND35處理均能提高兩種小麥的脫水素基因wzy2表達(dá)量，其中山農(nóng)16抗旱型小麥脫水基因的表達(dá)量是對照組的2.21倍，山農(nóng)22敏感型小麥的表達(dá)量是對照組2.53倍。說明，干旱脅迫條件下，球毛殼菌ND35可以明顯提高小麥脫水素wzy2基因的表達(dá)量，而且對不同敏感型小麥的作用效果存在差異。

圖4 球毛殼ND35對不同小麥品種脫水素基因wzy2表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of Chaetomium globosum ND35 on expression of wzy2 in different wheat varieties

3 討論

3.1 球毛殼菌ND35促進(jìn)小麥根系和植株生長及其對抗旱性的影響

根系作為水分吸收的主要器官，與植物抗旱性的形成具有密切關(guān)系。因此，植物的根系生長狀況是衡量其抗旱性的重要指標(biāo)，影響其對土壤水分的吸收和利用[17]。多數(shù)研究認(rèn)為，發(fā)達(dá)的根系可提高植物吸水效率，增強(qiáng)其抗旱性能，如抗旱性大豆具有較大的根系[18]。Redman等人研究表明，內(nèi)生菌的定殖促進(jìn)了水稻的根部生長和發(fā)育，影響了植物體內(nèi)營養(yǎng)在根和芽中的分配，內(nèi)生菌共生的植物優(yōu)先將營養(yǎng)分配給根部，而根部的發(fā)育則有利于植物對氮素的吸收和利用[19]。此外，葉片相對含水量作為植物抗旱性的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確說明植株的干旱適應(yīng)性。過去的研究證明，球毛殼菌ND35對楊樹、黃瓜和板栗根系的發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，山農(nóng)16小麥ND35處理組根系的平均長度、根冠比和植株總蛋白含量相對于對照組更高，山農(nóng)22小麥ND35處理組平均苗高大于對照組，植株含水量也大于對照組；正常水分條件下，兩種小麥的苗高、根長和根系活力比對照組均顯著提高，這些數(shù)據(jù)表明球毛殼菌ND35處理的不同水分敏感型小麥的植株生長和個體對干旱的適應(yīng)性均強(qiáng)于對照組。此外，球毛殼菌ND35處理的小麥生長效率普遍提高，提前進(jìn)入三葉期。因此，球毛殼菌ND35促進(jìn)兩種小麥品種根系發(fā)育所引起的小麥對水分和養(yǎng)分吸收利用能力的提高，以及個體生長期的提前所引起的小麥避旱能力的提高可能是影響小麥抗旱性的重要原因。

3.2 球毛殼菌ND35對增強(qiáng)小麥抗旱性的影響

干旱條件發(fā)生時，土壤水勢的降低會迫使植物失水，從而對小麥造成直接或間接傷害。小麥在根部積累滲透脅迫物質(zhì)可以降低植物細(xì)胞水勢，達(dá)到減少植株失水的目的。比較普遍的調(diào)節(jié)物質(zhì)是脯氨酸、可溶性糖、脫落酸及生長調(diào)節(jié)酶的活性，這些生理指標(biāo)在植物抵御干旱脅迫、鹽害等非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用[22]。萬里強(qiáng)等研究，抗旱性強(qiáng)的黑麥品種葉片的脯氨酸含量顯著增加[23]。一些研究還表明，干旱脅迫條件下，菌根植物具有較高的脯氨酸積累[24]。本試驗(yàn)中，干旱脅迫下的兩種小麥葉片脯氨酸含量明顯高于正常水分組。一方面，不同小麥品種間脯氨酸含量的變化和品種本身的遺傳有關(guān)，從而表現(xiàn)出合成脯氨酸的潛力有所不同[25]。另一方面，在不同的遺傳條件下，接種球毛殼菌ND35均可以提高小麥的脯氨酸含量。說明在干旱條件下，球毛殼菌ND35可以促進(jìn)小麥脯氨酸積累，在維持細(xì)胞滲透勢方面起到積極作用。另外，處理組中的葉片可溶性糖含量及過氧化氫酶活性比對照組均有不同程度的提高。葉片中的可溶性糖能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，對植株抗旱，抗鹽發(fā)揮不可替代的作用。過氧化氫酶可以分解過氧化氫，最大限度地減少羥自由基的形成。MDA是細(xì)胞膜過氧化的主要產(chǎn)物之一，對膜和細(xì)胞中的許多生物功能分子如蛋白質(zhì)、核酸和酶等均有很強(qiáng)的破壞作用，其含量多少可作為細(xì)胞膜過氧化程度的指標(biāo)之一[26]，而本試驗(yàn)中球毛殼菌ND35處理組MDA含量比對照組均有不同程度的降低。以上生理指標(biāo)表明，在干旱脅迫條件下，處理組小麥的抗旱性比對照組均有不同程度的增強(qiáng)，反映出較高水平的抗旱適應(yīng)性。

3.3 球毛殼菌ND35提高小麥wzy2基因表達(dá)對耐旱性的影響

小麥在生長發(fā)育進(jìn)程中，干旱脅迫能誘導(dǎo)許多基因的表達(dá)，來緩解由于干旱所造成小麥機(jī)體損傷。這種由于調(diào)控因子引起的分子效應(yīng)可能是植物耐旱機(jī)制的關(guān)鍵。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和微生物分子生物學(xué)技術(shù)的日趨成熟，關(guān)于內(nèi)生菌提高植物抗性基因表達(dá)的報道陸續(xù)發(fā)布。Sherameti 等研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，接種印度梨形孢(Piriformosporaindica)的擬南芥植株RD29A、ERA1、DREB2A、CBL1等抗逆性相關(guān)基因的表達(dá)都有不同程度的上調(diào)，而在未接菌的植株中的表達(dá)相對滯后[27]；Sun 等人的研究表明內(nèi)生菌在甘藍(lán)體內(nèi)定殖后，會促進(jìn)甘藍(lán)葉片中抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，并提高抗旱相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而賦予甘藍(lán)更強(qiáng)的抗旱能力[28]；Ownley 等人發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的侵染能增強(qiáng)植物抗病基因的表達(dá)[29]。因此，研究相關(guān)干旱誘導(dǎo)基因在脅迫條件下其mRNA水平的表達(dá)，很大程度上為揭示作物的抗旱機(jī)制提供了不可缺少的信息?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為脫水素是一種常見的干旱誘導(dǎo)基因，與植物耐脫水性密切相關(guān)。一方面，脫水素在植物受到干旱失水時，能夠部分代替水分子，保持細(xì)胞液處于溶解狀態(tài)，從而穩(wěn)定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[30]；另一方面，脫水素還起到分子伴侶和親水性溶質(zhì)作用，在水分脅迫條件下可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并保持其功能，所以脫水素基因在干旱脅迫植株中大量表達(dá)[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在干旱脅迫條件下，接種球毛殼菌ND35的兩種小麥品種的wzy2基因的表達(dá)量較對照組均顯著提高。由此說明球毛殼菌ND35可能通過上調(diào)干旱誘導(dǎo)基因wzy2的表達(dá)量，提高小麥耐脫水性來適應(yīng)個體對干旱脅迫響應(yīng)，從而提高小麥的耐旱能力，這也為球毛殼菌ND35提高小麥干旱適應(yīng)性提供了依據(jù)。

綜上所述，本試驗(yàn)說明接種球毛殼菌ND35能夠促進(jìn)兩種不同水分敏感型小麥的根系和植株發(fā)育，協(xié)調(diào)個體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)來提高小麥的耐旱和避旱能力，上調(diào)干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而提高個體對干旱脅迫的適應(yīng)性。具體從3個方面得到驗(yàn)證：(1)球毛殼菌ND35促進(jìn)小麥根系和植株生長，小麥生長效率提高，提前進(jìn)入三葉期，增強(qiáng)小麥避旱性，同時提高小麥根系活力，增強(qiáng)小麥耐旱性；(2)球毛殼菌ND35提高小麥細(xì)胞內(nèi)水分，糖分，脯氨酸含量，降低丙二醛造成的細(xì)胞膜氧化傷害，增強(qiáng)過氧化氫酶活性，這些對維持和提高小麥正常滲透勢，增強(qiáng)小麥耐旱性起到關(guān)鍵作用。(3)通過熒光定量手段檢測發(fā)現(xiàn)，球毛殼菌ND35會促進(jìn)小麥脫水素基因wzy2的表達(dá)，進(jìn)而提高抗旱相關(guān)蛋白的表達(dá)，使小麥獲得更強(qiáng)的耐脫水性和抗旱能力。另外，根系作為首先感應(yīng)水分脅迫的器官，球毛殼菌ND35是否增加根系細(xì)胞對干旱脅迫的感應(yīng)能力，是否增加植物對干旱脅迫信號的傳導(dǎo)以及是否對更多品種小麥的抗旱性產(chǎn)生同樣的效果，有待深入研究。

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Effect of the endophytic fungusChaetomiumglobosumND35 on the growth and resistance to drought of winter wheat at the seedling stage under water stress

CONG Guoqiang, YIN Chenglin, HE Bangling, LI Ling, GAO Kexiang*

ShandongKeyLaboratoryforAgriculturalMicrobes,CollegeofPlantProtection，ShandongAgriculturalUniversity,Tai′an271000,China

Endophytes are microbes that live in plant tissues without substantively harming them selves．They are ubiquitous in most plant species, latently residing in or actively colonizing the tissues．To clarify the effect of endophytic fungus on the growth and resistance to drought of winter wheat at the seedling stage under different water conditions, two wheat varieties, Shannong No. 16 and Shannong No. 22, were used as test materials. The dehydrinwzy2 belonging to the dehydration-responsive encoding gene was detected to master different expression of winter-wheat-related genes under drought stress by using a fluorescence quantitative PCR technique. The growth and development of plant and physiological responses under drought stress were investigated by measuring the related physiological indicators and enzyme activity. The results showed that, compared with ND35 groups treated with the normal water,ChaetomiumglobosumND35 could significantly improve root-shoot ratio, proline content, protein content, and malondialdehyde (MDA) content of two wheat varieties in the drought group. The water content and soluble sugar content of leaves were reduced slightly in two wheat varieties. In the drought treatment group,C.globosumND35 could promote root growth of Shannong No. 16 and increase the plant height of Shannong No. 22. The proline content, soluble sugar content, and catalase (CAT) activity of Shannong No. 16 treated withC.globosumND35 group were increased more than in the control group, while the MDA was reduced by 9.0%. Proline and CAT activity increased and there was an indistinctive difference in soluble sugar content in Shannong No. 22, while the MDA content was reduced. The relative quantitative expression ofwzy2 gene was examined. The results showed that dehydrin gene expression in the two wheat varieties inoculated withC.globosumND35 was increased significantly, compared with that of the control group. Above all, the endophytic fungusC.globosumND35 could promote seedling root and plant growth, the wheat could develop into three-leaf stage earlier, and resistance to dehydration was enhanced. In addition, wheat root vigor was improved and resistance to drought was increased. The individual water content, sugar content, and proline content in cells were increased, oxidative damage caused by malondialdehyde was reduced, and the activity of catalase was enhanced, thus improving wheat tolerance to drought stress. The expression of related geneswzy2 in quantity was obviously increased in wheat inoculated withC.globosumND35, and then the expression of resistance to drought-related proteins was improved. As a result, resistance and adaptability to drought stress were improved in winter wheat plants.

wheat; seedling growth; endophytic fungus;ChaetomiumglobosumND35; water stress; dehydrin gene expression

國家自然科學(xué)基金(30872024); 山東省科技發(fā)展計劃(2010GNC10911)

2014-01-20;

日期:2014-11-19

10.5846/stxb201401200153

*通訊作者Corresponding author.E-mail: kxgao@sdau.edu.cn

叢國強(qiáng), 尹成林, 何邦令, 李玲, 高克祥.水分脅迫下內(nèi)生真菌球毛殼ND35對冬小麥苗期生長和抗旱性的影響.生態(tài)學(xué)報,2015,35(18):6120-6128.Cong G Q, Yin C L, He B L, Li L, Gao K X.Effect of the endophytic fungusChaetomiumglobosumND35 on the growth and resistance to drought of winter wheat at the seedling stage under water stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6120-6128.