何 悅，肖會敏，黨 珍，王四旺（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，西安 710032）

紫參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

何 悅，肖會敏，黨 珍，王四旺＊（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，西安 710032）

目的 研究紫參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。方法 ①采用TLC法對制劑中當(dāng)歸、靈芝、丹參藥材及丹參酮ⅡA進(jìn)行鑒別；②采用HPLC法，以乙腈－3.0mg·mL－1磷酸溶液為流動相，運用梯度洗脫法分別測定制劑中甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、丹參酮ⅡA的含量，使用Inter sustain C18色譜柱（250mm×4.6mm，5.0μm），檢測波長為260nm。結(jié)果 ①制劑中當(dāng)歸、靈芝、丹參藥材及丹參酮ⅡA的薄層鑒別具有較好的專屬性；②甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、丹參酮ⅡA的線性范圍分別為0.006 4～0.256 0，0.042 0～1.680 0，0.006 5～0.260 0和0.002 3～0.092 0mg·mL－1；相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 6，0.999 1，0.999 3和0.999 4；③甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、丹參酮ⅡA平均加樣回收率分別為98.9%，99.0%，99.3%和99.9%；RSD分別為0.64%，0.46%，0.29%和0.78%；④10批制劑中甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.83，10.55，1.43和0.20mg·g－1，RSD分別為1.22%，1.13%，0.98%和1.19%。結(jié)論 所建立的標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)合理，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

紫參片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

紫參片主要由紫河車、丹參、當(dāng)歸、靈芝、甘草等中藥組成，主要用于放療與化療的防治。紫河車成分復(fù)雜，其主要含有氨基酸、激素、細(xì)胞因子等成分，具有雙重滋補(bǔ)作用，既能壯陽，又能滋陰，為滋補(bǔ)珍品［12］。丹參主要活性成分有丹參酮類、丹酚酸類等，具有活血化瘀等功能［3－5］。當(dāng)歸主要活性成分有多糖類、黃酮類、揮發(fā)油等，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛等功能［68］。靈芝中含有有機(jī)鍺、靈芝多糖、三萜類等，具有提高免疫力、降血脂、降血糖等作用［9］。甘草主要活性成分有三萜皂苷和黃酮類等，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效［10］。紫參片采用水提與醇提取［11］，經(jīng)噴霧干燥［12］、壓片、包衣制成。為了保證制劑的療效，對該制劑進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀（型號2010CHT，Lab Solusion色譜工作站，日本島津公司）；萬分之一電子分析天平（型號ME235S，德國賽多利斯公司）；SK250－LHC超聲波發(fā)生器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 丹參、當(dāng)歸及靈芝對照藥材與甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、丹參酮ⅡA對照品等，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫參片（批號20130501，20130502，20130503，20130504，20130605，20130506，20130607，20130608，20130609，20130610），第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所研制；乙腈、甲醇（色譜級，美國Honeywell公司）；水為自制超純水（由Millipore純水儀制備，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司）；其余為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參藥材及丹參酮ⅡA TLC鑒別 取本品5片，除去薄膜衣，研細(xì)，加石油醚（30～60℃）5mL，振搖，放置2h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液與陰性樣品（按處方比例根據(jù)本品制備工藝制成缺丹參的片劑）溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按照文獻(xiàn)方法［13］實驗，吸取供試品溶液10μL及對照藥材溶液和對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。結(jié)果在供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2 當(dāng)歸藥材TLC鑒別 取本品5片，除去薄膜衣，研細(xì)，加石油醚（30～60℃）20mL，超聲提取25min，濾過，濾液揮至1mL，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液與陰性樣品（按處方比例根據(jù)本品制備工藝制成缺當(dāng)歸的片劑）溶液。按照文獻(xiàn)［13］實驗，吸取供試品溶液10μL及對照藥材溶液4μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365nm）下檢測。結(jié)果在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.3 靈芝藥材TLC鑒別 取本品5片，除去薄膜衣，研成細(xì)粉，加氯仿10mL，超聲處理30min，濾過，濾液揮至1mL，作為供試品溶液。另取靈芝對照藥材2g，加氯仿15mL，同法制成對照藥材溶液與陰性樣品（按處方比例根據(jù)本品制備工藝制成缺靈芝的片劑）溶液。按照文獻(xiàn)方法［13］實驗，吸取供試品液10μL及對照藥材溶液8μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯－乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Inter sustain C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－3.0 g·L－1磷酸溶液（B）梯度洗脫，0～45min：B 10%～64%；45～60min：B 64%～99%：60～70min：B 99%。體積流量：1.0mL·min－1；柱溫：25℃；檢測波長：260nm；進(jìn)樣量：20μL［14］。

2.4.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取甘草苷12.80mg、甘草酸13.00mg、丹參酮ⅡA4.60mg，置于5mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，搖勻，即得3個對照品的混合溶液（A溶液）；另精密稱取丹酚酸B 16.80mg，置于10mL量瓶中，加入精密量取的A溶液1.0mL，再加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，搖勻，即得4個對照品的混合溶液，作為儲備液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取10片本品，去除薄膜衣，研成細(xì)粉，稱取1.0g，精密稱定，置于25mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇適量，超聲30min，放涼，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，濾過（0.45μm濾膜），濾液作為供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系 精密量取儲備液0.025，0.125，0.250和0.500mL，分別置于1mL的量瓶中，分別加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，搖勻，即得；儲備液作為線性關(guān)系最高質(zhì)量濃度溶液。上述溶液分別濾過（0.22μm濾膜），取20μL，分別注入液相色譜儀，考察對照品質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見圖1和表1，表明其在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度實驗 取線性考察樣品溶液（0.25 mL儲備液加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇定容至1mL）連續(xù)進(jìn)樣6次，測定甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.68%，0.75%，0.88%和0.92%，說明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實驗 取線性考察樣品溶液（同2.4.5項），按上述色譜條件測定，分別在第0，1，2，4，8，12和24h進(jìn)樣1次。結(jié)果甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為0.70%，0.86%，0.86%和0.98%，說明在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性實驗 分別稱取紫參片（批號20130501）6份樣品，精密稱定，按供試品制備方法制備，按上述色譜條件測定，結(jié)果制劑中甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA平均含量（mg·g－1）分別為1.186，15.073，2.040和0.293mg·g－1，RSD分別為1.25%，1.07%，1.01%和0.95%，說明該方法重復(fù)性良好。

圖1 HPLC圖A.混合對照品；B.紫參片供試品；C.缺丹參陰性對照；D.缺甘草陰性對照；1.甘草苷；2.丹酚酸B；3.甘草酸；4.丹參酮ⅡAFig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.sample；C.negative control（lack of Salvia miltiorrhiza）；D.negative control（lack of licorice）1.liquiritin；2.salvianolic acid B；3.glycyrrhizic acid；4.tanshinoneⅡA

表1 各對照品的線性方程及其質(zhì)量濃度范圍Tab.1 Linear equations of each control sample and its concentration range

2.4.8 加樣回收率實驗 取本品10片（批號20130501，其中甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA平均含量分別為1.186，15.073，2.040和0.293 mg·g－1），除去薄膜衣，研細(xì)，稱取細(xì)粉1g，精密稱定，添加1.0或2.0或4.0mL混合對照品溶液（分別精密稱取甘草苷9.00mg、丹酚酸B 60.00mg、甘草酸15.00mg、丹參酮ⅡA 2.10mg，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇15mL，搖勻，即得），按照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2，表明本方法具有良好的回收率。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Results of the recovery test

2.4.9 含量測定 按照供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，按外標(biāo)法計算，10批制劑中甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.83，10.55，1.43和0.20mg·g－1，RSD分別為1.22%，1.13%，0.98%和1.19%，說明不同批次間均一性較好。

3 分析討論

3.1 TLC鑒別 丹參為方中臣藥，成分明確，其水溶性有效成分和脂溶性有效成分均對低劑量輻射損傷有保護(hù)作用。因此，曾對丹參藥材及其丹參酮ⅡA和丹酚酸B進(jìn)行鑒別，結(jié)果檢出丹參藥材及丹參酮ⅡA特征斑點，由于該展開系統(tǒng)簡單，重復(fù)性好，陰性對照無干擾，方法簡便靈敏，故列入正文；而丹酚酸B特征斑點不清晰，經(jīng)增加取樣量及更換展開劑系統(tǒng)，結(jié)果依然不清晰，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)歸是臣藥，依據(jù)文獻(xiàn)［15］方法，曾對當(dāng)歸中阿魏酸進(jìn)行鑒別，結(jié)果特征斑點不清晰，且陰性對照產(chǎn)生干擾；經(jīng)選用不同的制樣方法與不同的展開系統(tǒng)實驗，結(jié)果特征斑點依然不清晰，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；而依據(jù)文獻(xiàn)［13］對當(dāng)歸藥材進(jìn)行鑒別，結(jié)果檢出清晰的當(dāng)歸特征斑點，同時陰性對照無干擾，重復(fù)性好，故列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。靈芝是臣藥，依據(jù)文獻(xiàn)［13］對靈芝藥材進(jìn)行鑒別，結(jié)果可檢出特征清晰的靈芝斑點，且陰性對照無干擾，重復(fù)性好，故列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。甘草為方中調(diào)和藥，曾對甘草酸或甘草次酸進(jìn)行鑒別，結(jié)果因制劑中含量低，未檢出。依據(jù)文獻(xiàn)［13］，對制劑中甘草藥材進(jìn)行鑒別，結(jié)果可以檢出特征斑點但不清晰，同時重復(fù)性較差，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 含量測定 丹參為方中臣藥，甘草為方中調(diào)和藥，丹參酮ⅡA、丹酚酸B、甘草苷、甘草酸等為其主要活性成分。根據(jù)其制備工藝，已經(jīng)大部分提出。對丹酚酸B、甘草進(jìn)行TLC鑒別不具有專屬性，因此選擇HPLC測定其含量，結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性與重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，簡單靈敏，故列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。紫河車為方中君藥，目前對紫河車成分含量研究的文獻(xiàn)報道不多，已知其主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、磷脂等，還含多種激素、干擾素等。由于成品為干燥品，其生物活性成分受加工炮制影響損失較大，對動物類蛋白質(zhì)選用茚三酮鑒別反應(yīng)［16］，陰性對照有干擾。因此，采用半微量法進(jìn)行了總氮含量測定，但考慮該指標(biāo)沒有實際用途，故未列入正文。

綜上所述，把具有良好穩(wěn)定性與重復(fù)性的含量測定項即甘草苷、丹酚酸B、甘草酸與丹參酮ⅡA含量測定，以及專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的TLC鑒別項即丹參ⅡA以及丹參酮、當(dāng)歸、靈芝藥材鑒別，納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以很好地控制制劑質(zhì)量。

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Study on the quality standard for Zishen Tablets

HE Yue，XIAO Huimin，DANG Zhen，WANG Siwang＊（New Materia Research Center，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Abstract：Objective To establish the quality standard for Zishen Tablets.Methods①Angelica root，Ganoderma lucidumand Salvia miltiorrhizain the preparation were identified by TLC.②HPLC with a gradient elution using acetonitrile－3.0mg·mL－1phosphoric acid as mobile phase was adopted to determine the contents of liquiritin，salvianolic acid B，glycyrrhizic acid and tanshinoneⅡA in the preparation.The analytical column was Inter sustain C18column（250mm×4.6mm，5.0μm）.And the UV detection wavelength was set at 260nm.Results①TLCs of Angelica root，Ganoderma lucidumand Salvia miltiorrhiza showed good specificity.②For liquiritin，salvianolic acid B，glycyrrhizic acid and tanshinoneⅡA，concentration range of regression equations were 0.006 4－0.256 1，0.042 0－1.680 0，0.006 5－0.260 0and 0.002 3－0.092 0mg·mL－1，respectively.And r were 0.999 6，0.999 1，0.999 3and 0.999 4，respectively.③The average recoveries of liquiritin，salvianolic acid B，glycyrrhizic acid and tanshinoneⅡA were 98.9%，99.0%，99.3%and 99.9%，respectively.And their RSDs were 0.64%，0.46%，0.29%and 0.78%，respectively.④In 10batches′preparation，the average contents of liquiritin，salvianolic acid B，glycyrrhizic acid and tanshinoneⅡA were 0.83，10.55，1.43and 0.20mg per tablet，respectively.And their RSDs were 1.22%，1.13%，0.98%and 1.19%，respectively.Conclusion The standard can be used for the preparation quality control.

Zishen Tablets；quality standard；TLC；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.003

R282

A

1004－2407（2015）02－0117－05

2014－09－10）

國家科技重大專項課題（編號：2008BMX01－1）

何悅，女，藥師

＊通信作者：王四旺，男，碩士，博士生導(dǎo)師