王宏歸，黃 晨，陳 鵬，姜 雅，張 婭，唐冬英，趙小英，劉選明?

(1.揚(yáng)州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

CONSTANS-LIKE 7基因?qū)M南芥開花的調(diào)控分析*

王宏歸1，黃 晨1，陳 鵬1，姜 雅1，張 婭1，唐冬英2，趙小英2，劉選明2?

(1.揚(yáng)州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082)

為研究CONSTANS-LIKE7 (COL7)在調(diào)控植物開花方面的功能，以定量PCR,GUS染色等方法，研究光及生物鐘對(duì)COL7表達(dá)的影響，以及COL7對(duì)擬南芥開花的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：光及生物鐘參與調(diào)控COL7的表達(dá)；過(guò)表達(dá)COL7在長(zhǎng)日照條件下抑制CONSTANS(CO)以及FLOWERINGLOCUST(FT)的表達(dá)，進(jìn)而抑制擬南芥開花；col7突變體不論是在長(zhǎng)日照下還是短日照下都沒(méi)有明顯的開花表型，說(shuō)明COL7在調(diào)控?cái)M南芥開化方面可能與其家族基因中的其它成員存在功能冗余.

基因表達(dá)；擬南芥；CONSTANS-LIKE7；開花

擬南芥是長(zhǎng)日照植物，長(zhǎng)日照促進(jìn)其開花[1].擬南芥從生殖生長(zhǎng)到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，是由內(nèi)部及外部因素共同決定的[2].目前在擬南芥中，主要有4條開花信號(hào)途徑：1)光周期途徑，2)自主途徑，3)赤霉素途徑、4)春化途徑[3-7].內(nèi)部及外部信號(hào)通過(guò)這4條途徑被傳遞至共同的整合子基因，如：FLOWERINGLOCUST(FT)，SUPPRESSIONOFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1)以及LEAFY(LFY)，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6, 8-9].光周期途徑是由光受體、生物鐘及生物鐘輸出途徑組成，光信號(hào)通過(guò)光受體(如：CRYPTOCHROMES(CRY) 1與2、FLAVIN-BINDING,KELCHREPEAT,F-BOX1 (FKF1)，ZEITLUPE(ZTL)，PHYTOCHROMES(PHY)AtoE等傳遞至生物鐘[10, 11].光周期途徑調(diào)控植物開花是通過(guò)CO，F(xiàn)T模式實(shí)現(xiàn)[12].CO的表達(dá)受光及生物鐘調(diào)控，其蛋白在光下穩(wěn)定，但在黑暗下被降解[13-15].CYCLING DOF FACTOR 1(CDF1)通過(guò)結(jié)合到CO的啟動(dòng)子上抑制CO的表達(dá)，進(jìn)而抑制FT的表達(dá)[16].FKF1與GIGANTEA(GI)形成復(fù)合體可以將CDF1降解，從而解除CDF1對(duì)CO抑制，促進(jìn)FT的表達(dá)[17-19].

在擬南芥中，CO家族有17個(gè)成員，且都含有CCT (CO, COL, and TIMING OF CAB1 EXPRESSION1 (TOC1))結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)域[20-21].CCT結(jié)構(gòu)與蛋白的核定位有關(guān)，同時(shí)也可以與HAP3及HAP5相互作用進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥的生長(zhǎng)發(fā)育[3, 21-22].鋅指結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白相互作用中起著重要的作用[3, 21-22].根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域的差異，可以將CO家族分成3組：第1組，CO，COL1～COL5，它們都含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；第2組，COL6～COL8以及COL16它們只含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；第3組，COL9～COL15它們都含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)分化的鋅指結(jié)構(gòu)域[20-21].

在CO基因家族中，只有CO，COL1，COL2，COL3，COL5，COL7及COL9被報(bào)道.CO是光周期開花途徑中的關(guān)鍵基因，其通過(guò)結(jié)合到FT的啟動(dòng)子上激活FT的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控開花[12].COL1，COL2的表達(dá)是受生物鐘調(diào)控，而且對(duì)擬南芥開花只有微弱的影響[23].COL3突變體不論在長(zhǎng)日照條件下還是在短日照條件下都具有晚花表型，此外，COL3還參與調(diào)控側(cè)根的形成，以及影響芽的伸長(zhǎng)與側(cè)枝的形成[24].過(guò)表達(dá)COL5只有在短日照下才能促進(jìn)FT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)短日照下擬南芥開花[25].COL7它參與植物的遮陰反應(yīng)[26]；過(guò)表達(dá)COL9抑制開花，因其抑制CO與FT的表達(dá)[27].除了目前已經(jīng)被報(bào)道的CO及COLs基因外，其他COLs的功能目前還不清楚.在本研究中，將介紹COL7在調(diào)控?cái)M南芥開花方面的功能.

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長(zhǎng)條件

本研究所用的野生型擬南芥(Wild type，WT)為哥倫比亞(Columbia，Col).col7 突變體(GABI-639C04)由 Bernd Weisshaar提供(MPI for Plant Breeding Research; Cologne, Germany).COL7過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系COL7-OX-10 和COL7-OX-11是本實(shí)驗(yàn)室保存材料.擬南芥種子用10%的NaClO溶液侵泡10 min，無(wú)菌水洗5次，然后播在Murashige and Skoog medium(MS)培養(yǎng)基上，于4 ℃春化72 h后，分別轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)日照(16 h光照，8 h黑暗)(100 μmol·m2·s1)、短日照(8 h光照，16 h黑暗)(100 μmol·m2·s1)、黑暗、紅光(10 μmol·m2·s1)、遠(yuǎn)紅光(0.8 μmol·m2·s1)、藍(lán)光(30 μmol·m2·s1)下培養(yǎng).擬南芥培養(yǎng)溫度為 22±2 ℃.

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR分析

總的RNA提取使用IllustraRNAspin Mini Kit (GE Healthcare)試劑盒，cDNA的合成是利用2 μg總RNA以及SuperScript first-strand cDNA synthesis system (Invitrogen)試劑盒.qPCR分析使用的試劑、儀器分別是Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen)與MX3000 System (Stratagene).本研究中使用的定量PCR引物見表1.

表1 定量PCR引物

Tab.1 Quantitative PCR primers

引物名稱引物序列5’-3’qCOL7-FCGATGACGCTTTCCTATGCCqCOL7-RGTTTTGTCTGCCGTCTCCGTqFT-FCAACCCTCACCTCCGAGAATATqFT-RTGCCAAAGGTTGTTCCAGTTGTqCO-FTCCATTAACCATAACGCATACATTTCqCO-RCGGCACAACACCAGTTTCCqGI-FCTCATCCGTTTGCCTCTTTCAqGI-RTGGGACGGTTGTAATGAGTCAAqFKF1TGAAGCTGTGTGTTGGCGTAAqFKF1TAACCCCTTCCCCACCAAATqACTIN2GCTGAGAGATTCAGATGCCCAqACTIN2GTGGATTCCAGCAGCTTCCAT

1.3 COL7的亞細(xì)胞定位

利用基因槍將構(gòu)建好的35S::GFP-COL7質(zhì)粒轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，然后在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～24 h，取洋蔥表皮，于Olympus Confocal FluoView IX 70激光共聚焦顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 COL7的亞細(xì)胞定位分析

CO基因家族都是轉(zhuǎn)錄因子，而轉(zhuǎn)錄因子是在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄.COL7含有CCT結(jié)構(gòu)域，其與蛋白的核定位有關(guān).為明確COL7的亞細(xì)胞定位，利用35S::GFP-COL7質(zhì)粒去轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)12～24 h的培養(yǎng)后，取上表皮細(xì)胞在顯微鏡下觀察，綠色熒光在轟擊的洋蔥表皮細(xì)胞核中被檢測(cè)到(圖1)，這說(shuō)明COL7是核定位的蛋白.

1:明場(chǎng)，2:色熒光，3:API染色，4：1,2與3的疊加圖

2.2 COL7過(guò)量表達(dá)或者缺失對(duì)擬南芥開花時(shí)間 的影響

目前在已報(bào)道的CO基因家族中，部分參與調(diào)控?cái)M南芥開花.COL7參與調(diào)控?cái)M南芥遮陰反應(yīng)，那么COL7是否參與調(diào)控植物開花呢？為此，分別將COL7的過(guò)表達(dá)株系COL7-OX-10，COL7-OX-11，以及col7突變體、WT種在長(zhǎng)日照與短日照條件下，觀察開花表型.經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析開花葉片數(shù)以及開花時(shí)間發(fā)現(xiàn)：過(guò)量表達(dá)COL7在長(zhǎng)日照下抑制擬南芥開花，其開花時(shí)間與野生型相比大約要晚10 d(圖2(a)～(c))，而過(guò)量表達(dá)COL7在短日照下無(wú)抑制開花的作用(圖2(d)～(e))，COL7不論在長(zhǎng)日照還是在短日照下，其開花表型與野生型無(wú)顯著差異(圖2(a)～(e)).這說(shuō)明COL7在調(diào)控開花方面與其家族基因存在功能冗余.

2.3 COL7過(guò)量表達(dá)或者缺失對(duì)開花關(guān)鍵基因CO, FT表達(dá)的影響

FT是“成花素”也是整合子基因，他可將來(lái)自光周期以及其他開花途徑的信號(hào)整合，進(jìn)而調(diào)控植物開花.COL7抑制開花，那么其是否通過(guò)抑制FT表達(dá)進(jìn)而抑制開花？因此，將WT，COL7和COL7-OX種籽播種在MS培養(yǎng)基上，長(zhǎng)日照下培養(yǎng)7 d，然后每4 h取樣，共取1 d.提取樣品的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后利用定量PCR分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：FT在COL7-OX株系中的表達(dá)明顯下降(圖3(a)).抑制FT表達(dá)的基因有很多，那么COL7抑制FT的表達(dá)是直接抑制FT的表達(dá)還是通過(guò)其他基因來(lái)實(shí)現(xiàn)呢？為此，通過(guò)定量PCR分析樣品中CO基因的變化.定量PCR結(jié)果顯示：CO在COL7-OX株系里的表達(dá)是受抑制的，但是相對(duì)于野生型CO的表達(dá)變化不是特別大(圖3(b)).因此，COL7-OX株系里的FT的變化不僅僅是由CO引起的，即說(shuō)明：COL7抑制CO與FT的表達(dá).在目前的報(bào)道中，同時(shí)參與調(diào)控CO，F(xiàn)T表達(dá)的基因還有GI，F(xiàn)KF1，且GI，F(xiàn)KF1是光周期開花途徑中的正調(diào)控基因.那么COL7是否有可能通過(guò)抑制GI或FKF1來(lái)間接調(diào)控CO，F(xiàn)T？為此，利用定量PCR分析COL7-OX株系里GI，F(xiàn)KF1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：COL7不影響GI，F(xiàn)KF1的表達(dá)(圖3(c)～(d)).因此，COL7抑制開花是通過(guò)其自身抑制CO，F(xiàn)T的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn).

圖2 COL7的開花表型

2.4 COL7組織器官表達(dá)特異性分析

35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的COL7抑制韌皮部基因CO,FT的表達(dá)，那么COL7是否在韌皮部有表達(dá)？因此，COL7的組織表達(dá)對(duì)研究COL7的功能非常重要.以PCOL7::GUS轉(zhuǎn)基因植株來(lái)研究COL7的組織表達(dá).取在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)5 d的PCOL7::GUS轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行GUS染色.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COL7不僅在葉肉里表達(dá)，同時(shí)也在韌皮部里表達(dá)(圖4(a)).此外，為了明確COL7在擬南芥各組織器官里的表達(dá)情況，取在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)35 d的野生型植株的各個(gè)組織器官，利用定量PCR的方法進(jìn)行分析COL7的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COL7在葉片、花里面表達(dá)比較多，而在根，莖，果夾中表達(dá)較少(圖4(b)).

2.5 COL7時(shí)空表達(dá)模式分析

因?yàn)镃OL7是光周期途徑中的開花抑制因子，分析COL7在不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，對(duì)揭示COL7的基因功能有很重要的作用.所以，收集在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)7,15,25和35 d的野生型植株，提取樣品RNA，利用定量PCR分析COL7的表達(dá)情況，定量PCR結(jié)果顯示：COL7的表達(dá)從第7 d到第15 d這個(gè)過(guò)程中有明顯的增加，而在15 d以后基本上保持相同的水平，因此，COL7的表達(dá)具有一定的時(shí)間性(圖5(a)).COL7在葉片的表達(dá)量最高，那么COL7在不同的葉片中的表達(dá)量是否相同呢？以在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)35 d的WT為材料，分別取子葉、第1片真葉、第4片真葉、第7片真葉、頂葉，然后利用定量PCR的方法分析COL7的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COL7在最低層的葉片中表達(dá)最少，而在最頂端的葉片中表達(dá)最多，即在離地面越遠(yuǎn)的葉片中COL7表達(dá)量越高(圖5(b)).因此，COL7的表達(dá)具有空間性.

圖3 長(zhǎng)日照下COL7抑制FT，CO的表達(dá)

圖4 COL7在韌皮部有表達(dá)

2.6 光對(duì)COL7基因表達(dá)的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COL7在光周期途徑中參與調(diào)控?cái)M南芥開花，那么COL7是否受光調(diào)控呢？分別取在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)7 d、短日照條件下生長(zhǎng)15 d的野生型幼苗，每4 h取一次樣，共取一天，然后利用定量PCR分析COL7的表達(dá)情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COL7主要在白天表達(dá)，且其在開燈后第4 h表達(dá)量最高，無(wú)論是在長(zhǎng)日照還是短日照下COL7的表達(dá)都受光誘導(dǎo)(圖5(c)).因此，光誘導(dǎo)：COL7表達(dá).白光是由不同的單色光組成，那么紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光是否同樣會(huì)誘導(dǎo)COL7的表達(dá)呢？將野生型幼苗在黑暗下培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)移到紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光下，并分別在0，0.5，1，2，4，8 h取樣，再利用定量PCR分析紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光對(duì)COL7表達(dá)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：紅光、遠(yuǎn)紅光、藍(lán)光也都會(huì)誘導(dǎo)COL7的表達(dá)(圖5(d)).

圖5 COL7的表達(dá)

3 討 論

過(guò)量表達(dá)COL7只在長(zhǎng)日照條件下抑制擬南芥開花.因此，COL7抑制擬南芥開花與光照時(shí)間密切相關(guān).COL7無(wú)論是在長(zhǎng)日照還是短日照條件下，其開花時(shí)間與WT沒(méi)有顯著的差異.這說(shuō)明COL7在調(diào)控開花方面與其家族基因存在功能冗余.COL7過(guò)表達(dá)的晚花表型是通過(guò)抑制CO，F(xiàn)T表達(dá)時(shí)實(shí)現(xiàn)的.FT是整合子基因，它可以將來(lái)自光周期途徑的信號(hào)以及其它途徑的信號(hào)整合，進(jìn)而調(diào)控植物開花.光周期途徑是通過(guò)介導(dǎo)光以及環(huán)境中的一些臨時(shí)信號(hào)來(lái)調(diào)控一系列的開花基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物開花.GI，F(xiàn)KF1即參與調(diào)控CO的表達(dá)，同時(shí)也參與調(diào)控FT的表達(dá).然而COL7抑制CO，F(xiàn)T的表達(dá)并不是通過(guò)GI，F(xiàn)KF1，因?yàn)镃OL7不影響GI，F(xiàn)KF1的表達(dá).過(guò)表達(dá)COL7晚花是因?yàn)镃O，F(xiàn)T的表達(dá)受到抑制，目前CO家族中已經(jīng)報(bào)道的基因只有COL9與COL7在調(diào)控開花方面具有相似的功能，COL9在長(zhǎng)日照下抑制開花，其也是通過(guò)抑制CO，F(xiàn)T的表達(dá).光信號(hào)在光周期其途徑中起著很重要的作用，COL7的表達(dá)受光的調(diào)控，且COL7抑制開花受光照時(shí)間調(diào)控.COL7是開花抑制子，但是COL7有可能不是單獨(dú)起作用，可能與其他基因一起參與調(diào)控開花.因?yàn)?，一般情況下開花抑制因子在從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)后其表達(dá)量是下降的，然而COL7的時(shí)空表達(dá)情況說(shuō)明，COL7在擬南芥從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)的過(guò)程中其表達(dá)是上升的，而且在新生的葉片中表達(dá)量最高，因此，COL7可能是與其他因子相互作用參與調(diào)控開花，而這些因子隨著植物的生長(zhǎng)逐漸減少，進(jìn)而導(dǎo)致COL7對(duì)開花的抑制減弱，其確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究.

總之，通過(guò)本研究首次發(fā)現(xiàn)：COL7是開花負(fù)調(diào)控因子，而且其通過(guò)抑制CO，F(xiàn)T的表達(dá)進(jìn)而抑制開花；COL7在韌皮部有表達(dá)，且COL7的表達(dá)具有時(shí)空特異性；COL7的表達(dá)受光調(diào)控，此外，COL7只在長(zhǎng)日照下抑制開花，這說(shuō)明COL7調(diào)控植物開花的功能與日照時(shí)間密切相關(guān).因此，光不僅參與調(diào)控COL7的表達(dá)，同時(shí)也影響COL7調(diào)控開花的功能.

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The Analysis of CONSTANS-LIKE 7 Regulateing Arabidopsis Flowering Time

WANG Hong-gui1，HUANG Chen1，CHEN Peng1，JIANG Ya1，ZHANG Ya1，TANG Dong-ying2，ZHAO Xiao-ying2，LIU Xuan-ming2?

(1.School of Environmental Science and Engineering, Yangzhou Univ, Yangzhou, Jiangsu 225127, China；2.Hunan Provence Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation, College of Biology, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410082, China)

To discover the function ofCONSTANS-LIKE7 (COL7) in regulating plant flowering, we used qPCR, GUS staining,etal, to study the light and circadian regulating the expression ofCOL7, andCOL7 regulating Arabidopsis flowering time. The results showed thatCOL7 was regulated by light and circadian, and the overexpressingCOL7 transgenic lines inhibited Arabidopsis flowering time under long-day (LD) condition through down-regulatingCONSTANS(CO) andFLOWERINGLOCUST(FT), and thecol7 mutant had no obvious flowering phenotype under LD or SD conditions. SoCOL7 may have redundant functions with otherCONSTANS-LIKEs(COLs) in controlling the flowering time of Arabidopsis.

gene expression;arabidopsis;CONSTANS-LIKE7; flowering

2015-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21307104),National Natural Science Foundation of China(21307104) ；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20150451)；江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14KJB180025)

王宏歸(1980-)，男，湖南衡陽(yáng)人，揚(yáng)州大學(xué)教師，博士

?通訊聯(lián)系人，E-mail:xmL05@hnu.edu.cn

1674-2974(2015)12-0088-07

Q786

A