劉菊燕， 巢建國(guó)， 谷 巍， 席蓓莉， 李孟洋

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

茅蒼術(shù)提取物含藥血清對(duì)大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

劉菊燕， 巢建國(guó)*， 谷 巍， 席蓓莉， 李孟洋

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

目的利用中藥血清藥物化學(xué)及血清藥理學(xué)方法，探討茅蒼術(shù)保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法測(cè)定

和比較茅蒼術(shù)提取物及其灌胃給藥前后大鼠空白和含藥血清中的入血成分，然后體外培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，建立

H2O2氧化損傷模型，以細(xì)胞形態(tài)、LDH釋放量、SOD活力、MDA水平及細(xì)胞相對(duì)凋亡情況為指標(biāo)，考察茅蒼術(shù)提取

物及其含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果茅蒼術(shù)提取物在血清中出現(xiàn)11個(gè)移行成分，其中7個(gè)為原型成分，

另外4個(gè)可能為代謝產(chǎn)物。H2O2損傷組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞皺縮并且變圓，數(shù)量明顯減少，LDH釋放量及MDA

水平明顯升高，SOD活性降低，細(xì)胞凋亡率增加；與H2O2損傷組相比，陽(yáng)性Vc對(duì)照組、茅蒼術(shù)提取物及其含藥血

清作用組的細(xì)胞數(shù)目增多，LDH釋放量和MDA水平均有不同程度的降低，SOD活性升高，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。結(jié)論茅蒼術(shù)提取物的11個(gè)入血成分可能為茅蒼術(shù)保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。

茅蒼術(shù)；血清藥物化學(xué)；血清藥理學(xué)；氧化損傷；H9c2心肌細(xì)胞

研究表明［1］，體內(nèi)抗氧化功能減弱以及自由基，特別是活性氧自由基 （ROS）的增加與各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。H2O2是一種重要的ROS，極易透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)Fe2+反應(yīng)，形成高活性的自由基，從而導(dǎo)致一系列反應(yīng)。由于其易于獲得，而且性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，因此已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［3］，一些中藥及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用，并且活性高、毒性小、臨床效果優(yōu)于單體。

茅蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.）DC.的干燥根莖，中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史悠久。藥理和臨床實(shí)驗(yàn)表明［4-5］，它具有保肝、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等作用，但對(duì)其抗氧化的作用機(jī)制及發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較為薄弱。本實(shí)驗(yàn)采用中藥血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)方法來(lái)探討茅蒼術(shù)保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的作用，為建立該植物及其提取物的多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，定時(shí)喂食全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料，室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2 藥材與試劑 茅蒼術(shù)采自江蘇省茅山地區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室巢建國(guó)教授鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（thumb.）Dc.的根莖，除去其雜質(zhì)及泥土，自然晾干后粉碎，過(guò)60目篩。

甲醇、乙腈為分析純 （美國(guó)天地試劑公司）；甲酸為分析純 （上海晶純生化科技股份有限公司）；澳洲胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶 （批號(hào)分別為1431602、NYH0948、20140216，美國(guó)Gibco公司）；青鏈霉素混合液（100X）、PBS磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）（批號(hào)分別為20140317、T20130825、509E024，北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜 （DMSO，批號(hào)為1028D005，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；抗壞血酸 （Vc，批號(hào)為100425-201103，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；LDH、SOD、MDA試劑盒 （批號(hào)分別為 20140417、20140331、20140321，南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括Agilent DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent Technologies公司）；Hedra C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5μm），包括5 cm保護(hù)柱 （江蘇漢邦科技有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （日本Sanyo公司）；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；752型紫外可見分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）；Model680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；Milli-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.4 細(xì)胞系 H9c2心肌細(xì)胞系 （中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法

2.1 茅蒼術(shù)提取物制備 茅蒼術(shù)藥材干燥粗粉用重蒸水浸泡1 h，回流提取2次，每次1 h，提取液合并后過(guò)濾，濾液減壓濃縮得到浸膏，65℃下烘干，即得茅蒼術(shù)提取物（每1 g相當(dāng)于生藥3.5 g），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 茅蒼術(shù)提取物供試液制備 精密稱取 “2.1”項(xiàng)下制備的茅蒼術(shù)提取物0.2 g，置于小燒杯中，緩慢加入95%乙醇，慢加快攪，至不再有絮狀物析出為止。然后靜置過(guò)夜，抽濾后將濾液濃縮，甲醇溶解并定容至50 mL，離心（3 000 r/min，10min），取上清液，過(guò)0.22μm微孔濾膜后取續(xù)濾液，即得茅蒼術(shù)提取物供試液，供HPLC分析用。

2.3 茅蒼術(shù)提取物灌胃樣品的制備 精密稱取 “2.1”項(xiàng)下制備的茅蒼術(shù)提取物適量，重蒸水溶解并配置成0.052 1 g/mL的茅蒼術(shù)提取物藥液，即得茅蒼術(shù)提取物灌胃樣品（約相當(dāng)于臨床成人用藥量的30倍）。

2.4 含藥血清和空白血清樣品制備［6］取成年健康SD大鼠10只，禁食12 h后眼眶取血，以1 mL/100 g的量灌胃給予 “2.3”項(xiàng)下制備的茅蒼術(shù)提取物藥液 （0.065 g/mL），空白組灌胃給予等量重蒸水，每日2次，連續(xù)3 d，末次給藥后2 h采集含藥和空白血液，取血前大鼠自由飲水。將空白和含藥血液低溫靜置40 min，凝結(jié)后低速離心15 min（3 000 r/min），分離血清。取上層血清1 mL，加乙腈5 mL后快速渦旋3 min，混勻，高速離心后取上清液，45℃氮吹儀吹干。殘?jiān)贸跏急壤牧鲃?dòng)相復(fù)溶，離心10 min（12 000 r/min），取上清液，供HPLC分析用。另取血清適量，56℃下水浴滅菌30 min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 HPLC條件 Hedra C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5μm），保護(hù)柱 5 cm；檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm；流量 0.6 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相為乙腈 （A）-0.25%甲酸水溶液 （B），梯度洗脫順序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫順序

2.6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)［7］H9c2心肌細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，至貼壁細(xì)胞達(dá)到瓶壁的85%～90%時(shí)，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，每2天更換1次培養(yǎng)液，按每孔5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板上。

2.7 心肌細(xì)胞藥物預(yù)處理、H2O2損傷及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 將96孔板中培養(yǎng)24 h后的H9c2細(xì)胞更換新的培養(yǎng)液，分組并加藥預(yù)處理方法如下。 （1）正常對(duì)照組：用培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。（2）H2O2損傷組：加入 H2O2使其終濃度為100 μmol/L，作用于細(xì)胞2 h。（3）陽(yáng)性Vc對(duì)照組：加入Vc溶液使其終質(zhì)量濃度為500μg/mL。（4）空白血清組：培養(yǎng)液中加入空白血清。（5）含藥血清組：培養(yǎng)液中加入含藥血清。（6）高劑量茅蒼術(shù)提取物作用組：加入 “2.1”項(xiàng)下茅蒼術(shù)提取物使其終質(zhì)量濃度為500μg/mL。（7）中劑量茅蒼術(shù)提取物作用組：加入茅蒼術(shù)提取物使其終質(zhì)量濃度為250 μg/mL。（8）低劑量茅蒼術(shù)提取物作用組：加入茅蒼術(shù)提取物使其終質(zhì)量濃度為100μg/mL。各處理組均為先加入H2O2損傷2 h，再加入藥物作用24 h，然后觀察細(xì)胞的形態(tài)，并收集各組培養(yǎng)液，檢測(cè)LDH釋放量、SOD活力、MDA水平及細(xì)胞活力。

3 結(jié)果

3.1 茅蒼術(shù)提取物入血成分的確定 含藥血清主要含有17個(gè)成分峰，與空白血清圖比較，6個(gè)為血清中的固有成分峰，但部分成分在含藥血清中的含有量明顯增大 （峰2、6、11），其原因有待進(jìn)一步研究；與茅蒼術(shù)提取物圖的18個(gè)峰比較，有7個(gè)成分直接進(jìn)入血清 （峰1、2、4、6、11、15、18），而且含藥血清峰1′、2′、3′、4′的來(lái)源可能是茅蒼術(shù)提取物在大鼠體內(nèi)的代謝成分，其確切來(lái)源需進(jìn)一步鑒別，見圖1。

3.2 茅蒼術(shù)提取物及其含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1 空白血清、茅蒼術(shù)提取物及其灌胃給藥后含藥血清的HPLC圖

H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行不同藥物處理之后，在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組的心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞核呈卵圓形并居中或緊貼細(xì)胞壁；H2O2損傷組和空白血清組的細(xì)胞體積均縮小，呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞邊緣模糊，出現(xiàn)溶解現(xiàn)象；陽(yáng)性Vc作用組的細(xì)胞與H2O2損傷組細(xì)胞相比，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；含藥血清組和不同劑量茅蒼術(shù)提取物作用組心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有所改善，細(xì)胞形態(tài)明顯好于損傷組，且貼壁細(xì)胞數(shù)量也多于損傷組；含藥血清對(duì)細(xì)胞有一定程度的保護(hù)作用，其生長(zhǎng)狀態(tài)好于空白血清組；不同劑量茅蒼術(shù)提取物作用組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不同，高劑量組生長(zhǎng)較好，中劑量組次之，低劑量組較差。

3.3 茅蒼術(shù)提取物及其含藥血清對(duì)H9c2心肌細(xì)胞LDH釋放量、SOD活力及MDA水平的影響 乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶 （SOD）活力測(cè)定結(jié)果及丙二醛（MDA）水平變化情況見表2。由表可知，H2O2損傷組的LDH釋放量和MDA水平明顯增高，分別為正常對(duì)照組的1.38倍和4.31倍，而SOD活力明顯降低，為正常對(duì)照組的34%；高、中、低劑量茅蒼術(shù)提取物作用組的LDH釋放量和MDA水平均有不同程度降低，LDH釋放量與H2O2損傷組比較，分別降低了16.01%、14.80%、8.14%，MDA與H2O2損傷組比較，分別降低了28.52%、60.70%、56.36%，顯示出劑量依賴關(guān)系；3種劑量茅蒼術(shù)提取物作用組的SOD活力均有不同程度升高，SOD與H2O2損傷組比較，分別升高了60.27%、48.55%、6.96%，而陽(yáng)性Vc對(duì)照組LDH釋放量和MDA水平明顯低于損傷組，但高于茅蒼術(shù)提取物作用組，并且SOD活力也明顯高于損傷組，但都沒有恢復(fù)至正常對(duì)照組水平；與空白血清組比較，含藥血清組亦能顯著升高SOD活力，降低MDA水平，但降低LDH含有量不顯著。

表2 茅蒼術(shù)提取物含藥血清對(duì)H9c2細(xì)胞H2O2損傷后LDH釋放量、SOD活力及MDA水平的影響(x±s,n=8)

3.4 茅蒼術(shù)提取物及其含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響每個(gè)處理組細(xì)胞的相對(duì)凋亡率用MTT法初步檢測(cè)判斷，結(jié)果如圖2。由圖可知，以正常對(duì)照組的相對(duì)存活率為標(biāo)準(zhǔn)，H2O2損傷組的損傷率顯著增高，為44.34%；3種劑量茅蒼術(shù)提取物作用組細(xì)胞的存活率分別為72.37%、66.19%、55.44%，與茅蒼術(shù)提取物濃度成明顯的效應(yīng)劑量關(guān)系，但低劑量組對(duì)H2O2損傷的H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯；與空白血清組相比，含藥血清組細(xì)胞的存活率也較高，為67.08%；與H2O2模型組比較，正常對(duì)照組、陽(yáng)性Vc對(duì)照組和茅蒼術(shù)提取物高劑量組均有非常顯著的差異，含藥血清組和茅蒼術(shù)提取物中劑量組有顯著性差異，其余組的差異不明顯。

圖2 不同處理組細(xì)胞的存活率

4 討論

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一直是困擾中藥現(xiàn)代化研究的一個(gè)瓶頸問題，目前相關(guān)研究的主要途徑是從各種中藥中提取分離得到大量化合物，并對(duì)其進(jìn)行一系列活性篩選，從而判斷它們是否具有活性。但由于中藥成分的復(fù)雜多樣性，故僅依此來(lái)判斷往往誤差較大［8］。自從20世紀(jì)80年代末日本學(xué)者田代真一初步提出血清藥理學(xué)和 “血清藥物化學(xué)”（serum pharmacochemistry，SPC）的概念后，90年代我國(guó)學(xué)者王喜軍教授也隨之提出 “中藥血清藥物化學(xué)”（serum pharmacocemistry of TCM）的概念，從此，血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)在研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面日益凸顯出其重要地位［9］。通過(guò)兩者的聯(lián)合應(yīng)用，既可以將體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，又可以初步判定進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效的成分 （即入血成分），從而更確切地反映中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［10］。

目前對(duì)茅蒼術(shù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少，本實(shí)驗(yàn)首次將血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)結(jié)合起來(lái)，用以研究該植物保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)應(yīng)用中藥血清藥物化學(xué)的方法，比較了茅蒼術(shù)提取物及其灌胃給藥前后含藥和空白血清的HPLC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)與茅蒼術(shù)相關(guān)的入血成分，其中7個(gè)是原型成分，另外4個(gè)是其經(jīng)過(guò)大鼠體內(nèi)代謝新產(chǎn)生的成分 （即血中移行成分）。同時(shí)，通過(guò)應(yīng)用中藥血清藥理學(xué)方法，并利用體外H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷模型模擬體內(nèi)氧化損傷，對(duì)茅蒼術(shù)提取物及其含藥血清作用H2O2處理過(guò)的H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者均具有保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的藥理活性，說(shuō)明其保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)為入血成分，結(jié)合血清藥物化學(xué)研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)初步判斷為7個(gè)茅蒼術(shù)的原型成分或4個(gè)移行成分，其具體物質(zhì)的鑒定尚有待于進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茅蒼術(shù)提取物的量效關(guān)系并不明顯，對(duì)各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)的效應(yīng)也并不平行，這可能正是中藥作用相對(duì)較緩和，以及 “多成分、多靶點(diǎn)、多渠道”特點(diǎn)的集中體現(xiàn)。而氧化損傷的病因機(jī)制是多環(huán)節(jié)多通路的，發(fā)揮藥效作用的往往不是一個(gè)有效成分，而是多個(gè)有效成分之間的相互協(xié)同、相加甚至拮抗的共同效應(yīng)來(lái)發(fā)揮療效，因此使其預(yù)防該疾病成為可能。本實(shí)驗(yàn)對(duì)探清茅蒼術(shù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，建立多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有積極意義。

［1］Dhalla N S，ElmoselhiA B，Hata T，etal.Status ofmyocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury［J］.Cardiovasc Res，2000，47（3）：446-456.

［2］Carvajal K，El HafidiM，Ba?os G.Myocardial damage due to ischemia and reperfusion in hypertrigly ceridemic and hypertensive rats：Participation of free radicals and calcium overload［J］.JHypertens，1999，17（11）：1607-1616.

［3］黃海霞，莫曉燕.中藥對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2003，34（12）：1150.

［4］付梅紅，朱東海，方 婧，等.蒼術(shù)的化學(xué)、分子生藥學(xué)和藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34（20）：2669-2672.

［5］詹丹丹，張 穎.淺談蒼術(shù)藥理作用及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2012，25（3）：459.

［6］王喜軍，孫文軍，孫 暉，等.茵陳蒿湯不同配伍變化對(duì)大鼠血中移行成分的影響［J］.中國(guó)天然藥物，2008，6（1）：43-47.

［7］鄭延松，李 源，張珊紅，等.用低濃度過(guò)氧化氫建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（20）：1849-1851.

［8］王喜軍.中藥及中藥復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2002，4（2）：1-4.

［9］王喜軍.中藥血清藥物化學(xué)學(xué)科的形成及發(fā)展［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12（4）：632-633.

［10］田友清，尚 靖，何 婷，等.基于中藥血清化學(xué)及血清藥理學(xué)方法探討香青蘭保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷物質(zhì)基礎(chǔ)［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（5）：620-624.

R966

：B

：1001-1528（2015）07-1585-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.044

2014-10-06

國(guó)家工業(yè)和信息化部2013年度中藥材生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目 （2013018）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目 （ysxk-2014）；國(guó)家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設(shè)項(xiàng)目 （2014-茅蒼術(shù)）

劉菊燕 （1988—），女，碩士，從事中藥資源培育與利用研究。Tel：18252067609，E-mail：niupi909@163.com

*通信作者：巢建國(guó) （1960—），男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥資源開發(fā)與研究。Tel：13851562488，E-mail：jgchaol016@ 163.com