馮婷婷， 魏紹斌， 王宇慧， 解 娟

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，四川成都610072）

內(nèi)異康復(fù)片對(duì)子宮腺肌病小鼠雌激素效應(yīng)因子P450arom、COX-2的時(shí)空變化影響

馮婷婷1， 魏紹斌2*， 王宇慧1， 解 娟1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，四川成都610072）

目的在臨床應(yīng)用內(nèi)異康復(fù)片治療子宮腺肌病取得明顯療效和前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用同種異體垂體移植方法建立子宮腺肌病動(dòng)物模型，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)P450arom、COX-2在治療前后各組小鼠子宮在位及異位內(nèi)膜上表達(dá)差異。方法選取8周齡ICR雌鼠62只，異體垂體移植方法造模，之后隨機(jī)設(shè)模型組、內(nèi)異康復(fù)片高、中、低劑量組、丹莪婦康煎膏組、孕三烯酮組。3個(gè)月后分別灌胃給藥，持續(xù)3個(gè)月，免疫組化方法觀察治療前后子宮在位及異位內(nèi)膜上P450arom、COX-2表達(dá)情況。結(jié)果P450arom、COX-2表達(dá)在不同治療方法治療后均下降，內(nèi)異康復(fù)片高劑量組優(yōu)于其他各治療組，與模型組比較，具有顯著差異 （P＜0.001），而且各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。結(jié)論內(nèi)異康復(fù)片能夠通過(guò)下調(diào)在位及異位內(nèi)膜雌激素效應(yīng)因子P450arom、COX-2表達(dá)，阻斷雌激素生成的正反饋環(huán)來(lái)抑制其產(chǎn)生，從而控制和治療子宮腺肌病，緩解臨床癥狀。

子宮腺肌?。粌?nèi)異康復(fù)片；P450 arom；COX-2

目前，子宮腺肌病 （AM）發(fā)病率日益增高，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床難以治愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為婦科領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題［1］。

“瘀血內(nèi)阻”為本病的核心病機(jī)已得到公認(rèn)，其病理實(shí)質(zhì)是 “離經(jīng)之血”聚而成瘀，瘀阻沖任胞宮而發(fā)病。導(dǎo)致瘀血內(nèi)停的常見(jiàn)病因有氣滯、寒凝、濕熱、痰凝、氣虛、腎虛等［2-5］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)瘀血內(nèi)阻和機(jī)體水濕運(yùn)行代謝障礙之間的相關(guān)性，結(jié)合四川盆地獨(dú)特的濕熱型地理特點(diǎn)，以及本病病機(jī)的復(fù)雜性和病情的難治性，提出 “濕熱瘀結(jié)”病機(jī)學(xué)說(shuō)。同時(shí)，采用清濕化瘀法治療本病，加以院內(nèi)制劑內(nèi)異康復(fù)片，臨床應(yīng)用5年已治療AM患者5 000余例，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，它在緩解痛經(jīng)及減少經(jīng)量方面具有明顯療效［6］。本實(shí)驗(yàn)以雌激素效應(yīng)為靶點(diǎn)，從不同時(shí)間和空間變化角度來(lái)探討內(nèi)異康復(fù)片對(duì)AM的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取已達(dá)到性成熟但未曾受孕的8周齡雌性ICR小鼠及同齡雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（28.0±3.0）g（成都簡(jiǎn)陽(yáng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，批號(hào)SCXK［川］2004-11，合格證號(hào)川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第8號(hào)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 內(nèi)異康復(fù)片 （清濕化瘀法代表方），由大血藤、半枝蓮、大黃、桃仁、土鱉蟲(chóng)、水蛭、三棱、莪術(shù)、鱉甲、牡蠣、浙貝、米仁組成 （四川省中醫(yī)院制劑室）；孕三烯酮膠囊 （國(guó)藥準(zhǔn)字H19980020）；丹莪婦康煎膏 （國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025253）。

1.3 動(dòng)物模型的建立 采用異體垂體宮腔移植法建模。該方法在國(guó)外已較為成熟［7-9］，3%戊巴比妥鈉為腹腔麻醉用藥，用量30～35 mg/kg，給予8周齡雌鼠腹腔注射。分層切開(kāi)雌鼠腹部皮膚層及皮下肌層，分離子宮，在膀胱下找到子宮分叉處。同時(shí)，處死雄鼠后開(kāi)顱取出垂體組織，少許生理鹽水混合，用自制套管針內(nèi)芯將垂體生理鹽水懸濁液0.5～1 mL緩慢推入雌鼠右側(cè)子宮腔，然后針頭及內(nèi)芯同時(shí)退出，將子宮放回腹腔，腹腔內(nèi)滴入慶大霉素溶液0.25 mL（1萬(wàn)U）預(yù)防感染，關(guān)腹。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 選取8周齡ICR雌鼠和雄鼠，各62只，取其中12只作為正常組，其余采用異體垂體移植方法造模，術(shù)后死亡2只。常規(guī)飼養(yǎng)3個(gè)月后，隨機(jī)取模型小鼠12只的異位組織送檢，病檢造模成功后再將其余48只隨機(jī)分為模型組、內(nèi)異康復(fù)片組、丹莪婦康煎膏組、孕三烯酮組。

正常組和模型組用蒸餾水 （0.4 mL/20 g）灌胃3個(gè)月。內(nèi)異康復(fù)片高劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成3.0 g/mL，稀釋后每天灌胃1次（0.4 mL/20 g，28倍于人體常用劑量。中劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成1.5 g/mL，稀釋后每天灌胃1次 （0.4 mL/20 g，14倍于人體常用劑量）。低劑量組：中藥浸膏用蒸餾水配成0.75 g/mL，每天灌胃1次 （0.4mL/20 g，7倍于人體常用劑量）。丹莪婦康煎膏用蒸餾水配成0.35mg/mL的水溶液，稀釋后每天灌胃1次（0.14 g/20 g）。孕三烯酮用蒸餾水配成0.02 mg/mL的水溶液，每周灌胃2次 （0.4 mL/20 g）。連續(xù)給藥3個(gè)月。

1.5 標(biāo)本采集與處理方法 末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出右側(cè)子宮，將其依次固定、脫水、包埋、切片，并免疫組化SP染色。

1.6 檢測(cè)方法 采用美國(guó)Media Cybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，在光學(xué)顯微鏡下分組觀察。結(jié)果，在40倍及100倍視野下分別找到在位及異位內(nèi)膜部位。同時(shí)，在200倍視野下選擇含陽(yáng)性物質(zhì) （即棕黃色顆粒物質(zhì)）最多的5個(gè)區(qū)域?yàn)g覽，先測(cè)量被覆上皮面積，再測(cè)量相應(yīng)面積中陽(yáng)性物質(zhì)的積分光密度，用于代表各指標(biāo)的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以x±s表示，定量指標(biāo)用單因素方差分析，組間比較用LSD、SNK分析和t檢驗(yàn)。

2 免疫組化結(jié)果

2.1 雌激素效應(yīng)因子P450arom隨時(shí)空變化的表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)小鼠子宮P450arom平均光密度值的影響(x±s,n=6)

2.2 雌激素效應(yīng)因子COX-2隨時(shí)空變化的表達(dá) 見(jiàn)表2。

表2 各組對(duì)小鼠子宮COX-2平均光密度值的影響(x± s,n=6)

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 在位內(nèi)膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，模型組高于正常組，而在治療后兩者水平均降低，內(nèi)異康復(fù)片高劑量組下降程度高于其他各組，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），而且各組間比較也有顯著性差異 （P＜0.01）。

2.3.2 異位內(nèi)膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，而在治療后兩者水平均降低，內(nèi)異康復(fù)片高劑量組下降程度高于其他各組，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而且各組間比較也有顯著性差異 （P＜0.01）。

3 討論

3.1 內(nèi)異康復(fù)片治療靶點(diǎn)的討論 在內(nèi)異康復(fù)片中，大血藤、半枝蓮清熱解毒止痛；薏苡仁清熱利濕排膿；大黃、桃仁活血導(dǎo)瘀下行；三棱、莪術(shù)、土鱉蟲(chóng)、水蛭破血逐瘀止痛；鱉甲、浙貝母散結(jié)消腫止痛。全方共奏清熱解毒利濕，化瘀消癥止痛之功。本方容經(jīng)方之義，參時(shí)方之效藥，經(jīng)時(shí)結(jié)合配伍嚴(yán)謹(jǐn)，力專效宏，是導(dǎo)師魏紹斌教授根據(jù)臨床實(shí)踐總結(jié)之經(jīng)驗(yàn)方，充分展現(xiàn)了清濕化瘀法的要旨，在臨床上廣泛使用。經(jīng)驗(yàn)證，其清濕化瘀止痛和止血療效確切，故本實(shí)驗(yàn)將其作為清濕化瘀法的代表方。

COX-2又稱前列腺素過(guò)氧化物合成酶，是PGE2合成的最主要限速酶之一，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻GE2，而它則是P450合成的誘導(dǎo)因子，并可使其合成增加［10-11］。異常增多的P450在雌激素合成過(guò)程中作為限速酶，催化高水平和高生物活性的雌二醇 （E2）合成，而E2又能反過(guò)來(lái)刺激COX-2合成，提高其生物學(xué)活性。因此，從COX-2、PGE2、P450到E2，再到COX-2之間形成一個(gè)惡性循環(huán)的雌激素生成正反饋環(huán)［12-14］，加劇AM對(duì)雌激素依賴性的病理變化程度，同時(shí)促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、黏附、轉(zhuǎn)移及增殖［6］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)內(nèi)異康復(fù)片各劑量組治療后，雌激素效應(yīng)因子P450、COX-2水平均有所下降，而且高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。由此可知，內(nèi)異康復(fù)片可有效改善AM的雌激素效應(yīng)異常，從而達(dá)到治療作用，它能通過(guò)降低在位及異位內(nèi)膜雌激素效應(yīng)因子P450 arom、COX-2表達(dá)，阻斷雌激素生成的正反饋環(huán)來(lái)抑制其產(chǎn)生。因此可認(rèn)為，雌激素效應(yīng)因子P450 arom、COX-2為內(nèi)異康復(fù)片的治療靶點(diǎn)。

3.2 不同劑量?jī)?nèi)異康復(fù)片對(duì)觀察指標(biāo)的影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同劑量的內(nèi)異康復(fù)組進(jìn)行對(duì)比，用于研究劑量對(duì)觀察指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，高劑量?jī)?nèi)異康復(fù)片對(duì)雌激素效應(yīng)因子的影響大于中劑量，但兩者比較，無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），而高、中劑量組與低劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。另外，內(nèi)異康復(fù)片不同劑量組與模型組比較，也均有顯著性差異 （P＜0.01）。由此可知，雌激素效應(yīng)因子的調(diào)控程度與內(nèi)異康復(fù)片的劑量相關(guān)，而且高劑量?jī)?nèi)異康復(fù)片的調(diào)控力大于中、低劑量。

3.3 不同治療藥物對(duì)觀察指標(biāo)的影響 本實(shí)驗(yàn)以中成藥丹莪婦康煎膏和西藥孕三烯酮為陽(yáng)性藥物，與內(nèi)異康復(fù)片進(jìn)行對(duì)照，用于探討不同治療藥物對(duì)觀察指標(biāo)調(diào)控力的大小。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)異康復(fù)片各劑量組和陽(yáng)性藥物組都能使觀察指標(biāo)在治療后下降，與模型組比較，均有顯著性差異 （P＜0.05）。其中，內(nèi)異康復(fù)片高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），其療效優(yōu)于丹莪婦康煎膏組和孕三烯酮組。另外，各治療組組間比較，也均有顯著性差異 （P＜0.01）。由此可知，內(nèi)異康復(fù)片高劑量組對(duì)在位及異位內(nèi)膜雌激素效應(yīng)因子P450arom、COX-2的影響高于丹莪婦康煎膏和孕三烯酮組，在有效改善雌激素效應(yīng)異常的同時(shí)減少西藥副作用，是值得深入研究的中藥復(fù)方。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1579-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.042

2014-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81273796）

馮婷婷 （1987—），女，博士，從事中醫(yī)藥防治盆腔疼痛病癥研究。Tel：13488972452，E-mail：232521259@qq.com

*通信作者：魏紹斌 （1957—），女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治盆腔疼痛病證研究。