張 雪， 謝曉芳， 熊 亮， 彭 成， 駱華剛， 楊雨婷

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137）

益母草芳香族化合物對(duì)大鼠體外凝血功能影響

張 雪， 謝曉芳， 熊 亮， 彭 成*， 駱華剛， 楊雨婷

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137）

目的探討益母草芳香族化合物對(duì)大鼠體外凝血功能和血小板聚集的影響。方法大鼠股動(dòng)脈取血，3.8%枸椽酸鈉-血液 （1∶9）抗凝后離心 （3 500 r/min），收集血漿，分組，然后按血漿與藥物9∶1的體積比例分別加入1%二甲基亞砜 （DMSO）、異歐前胡素 （YMC-19）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯 （YMC-23）、4′-羥基-2，3-二氫肉桂酸二十四酯（YMC-38）、對(duì)羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）、24R-5α-豆甾烷-3，6-二酮（YMC-42），血凝儀檢測(cè)各組凝血酶原時(shí)間 （PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間 （APTT）值。制備貧血小板血漿 （PPP）和富血小板血漿 （PRP），以PPP調(diào)零，將PRP加入比濁管中，再加入20μL受試藥物溶液，以ADP 20μL（終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL）誘導(dǎo)聚集，血小板聚集儀分別檢測(cè)血小板最大聚集率。結(jié)果1×10-5mol/L的YMC-19、YMC-23、YMC-38均能顯著延長(zhǎng)PT時(shí)間（P＜0.05），其中YMC-23、YMC-38還能顯著延長(zhǎng)APTT時(shí)間（P＜0.05），但對(duì)血小板最大聚集率的影響不明顯。結(jié)論YMC-23、YMC-38可能是益母草的活血成分，推測(cè)與抑制內(nèi)外源凝血途徑有關(guān)。

益母草；凝血；凝血酶原時(shí)間；活化部分凝血酶時(shí)間；血小板聚集

益母草為唇形科益母草屬植物L(fēng)eonurus japonicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分［1］，原名茺蔚，始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝、膀胱經(jīng)，具有活血化瘀、利尿消腫、清熱解毒之功效。文獻(xiàn) ［2］報(bào)道，益母草中含有多種化合物，包括萜類、苷類、生物堿類、黃酮類、脂肪酸類、揮發(fā)油類等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［3-4］，它具有溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低紅細(xì)胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧自由基等諸多作用。課題組前期從益母草藥材提取物中已分離得到芳香族化合物歐前胡素（YMC-19）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（YMC-23）、二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯 （YMC-38）、4-羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）和24R-25α-豆甾烷2，6二酮（YMC-42），其中YMC-38為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物，而其他化合物則是首次從益母草中發(fā)現(xiàn)。另外，所有化合物均經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀和核磁共振技術(shù)分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，純度均達(dá)99%以上，除YMC-23和YMC-42外，其他化合物的相關(guān)化學(xué)研究均已發(fā)表報(bào)道［5］。本實(shí)驗(yàn)主要從凝血和血小板聚集功能的方面來(lái)探討這些芳香族化合物的活血作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42均由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地提取分離獲得，純度均達(dá)99%以上。二甲基亞砜 （DMSO）將其配置成1×10-2mol/L的貯備液，-10℃下保存，使用前用生理鹽水稀釋成1×10-4mol/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，雌雄不拘，體質(zhì)量200～240 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，生產(chǎn)質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（川）2008-11。

1.3 主要儀器 CA-500系列全自動(dòng)血凝儀（日本Sysmex公司）；APACT/2型多通道血小板聚集儀 （德國(guó)蘭波公司）。

1.4 主要試劑 PT、APTT試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)105197、112133）；二磷酸腺苷二鈉 （adenosine-5′-diphosphate，ADP，美國(guó) Sigma公司，批號(hào)SLBB1854）；阿司匹林腸溶片 （云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)ZFA1401）；肝素鈉 （中國(guó)惠世生化試劑有限公司，批號(hào)090508）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠體外血漿凝血酶原時(shí)間 （PT）和活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）影響實(shí)驗(yàn) 取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，適應(yīng)環(huán)境后股動(dòng)脈采血，3.8%枸椽酸鈉-血液（1∶9）抗凝，離心10 m in（3 500 r/min），收集血漿后分為8管，按血漿與藥物9∶1的體積比例向8管中分別加入1%DMSO、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42，其藥物終濃度為1×10-5mol/L，陽(yáng)性對(duì)照為肝素鈉（35 U/mL），混勻后溫育5 m in，全自動(dòng)血凝儀測(cè)定各組PT和APTT值。

2.2 ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響實(shí)驗(yàn) 取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，適應(yīng)環(huán)境后股動(dòng)脈采血，3.8%枸椽酸鈉-血液 （1∶9）抗凝，離心10 min（800 r/min），制備富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再離心10 m in（4 000 r/min），制備貧血小板血漿（plateletpoor plasma，PPP）。以PPP調(diào)零，取200μL PRP加入比濁管中，37℃下溫育5 min，然后加入20μL受試藥物溶液，使阿司匹林、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42的終濃度均為1×10-5mol/L（空白組加入1%DMSO溶液20μL），混勻后繼續(xù)溫育5 min。然后加入ADP 20μL（終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL）誘導(dǎo)聚集，血小板聚集儀檢測(cè)血小板最大聚集率。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 （x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠體外血漿凝血酶原時(shí)間 （PT）和活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）的影響 與溶劑對(duì)照組比較，YMC-19、YMC-23和YMC-38的凝血酶原時(shí)間（PT）均明顯延長(zhǎng)，具有顯著性差異（P＜0.05）；YMC-23、YMC-38和YMC-41的活化部分凝血酶時(shí)間 （APTT）也均顯著延長(zhǎng) （P＜0.05或P＜0.01）。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，YMC-19、YMC-23、YMC-38和YMC-41具有一定的抗凝血活性，其中YMC-23和YMC-38可能是益母草的活血物質(zhì)，見(jiàn)表1。

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表1 益母草芳香族化合物對(duì)大鼠體外凝血功能的影響(x±s)

3.2 對(duì)ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42在終濃度為1×10-5mol/L時(shí)，對(duì)體外ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率均低于溶劑對(duì)照組，但不具有顯著性差異 （P＞0.05），即無(wú)明顯抑制作用，見(jiàn)表2。

表2對(duì)ADP誘導(dǎo)的體外血小板聚集的影響(x±s,n=10)

4 討論

《本草綱目》記載，益母草 “行血養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血，誠(chéng)為血家之圣藥也”，被視為治療月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、產(chǎn)后惡露不盡、瘀血腹痛等婦科疾病的常用良藥。研究發(fā)現(xiàn)，益母草還能抗菌［6］、降血脂［7］、抗腫瘤［8］等，而益母草水蘇堿則可明顯減少去甲腎上腺素 （NE）誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞表面積［9］。益母草中的化學(xué)成分是其發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，除含有生物堿、黃酮、二萜、糖苷、脂肪酸、揮發(fā)油、環(huán)型多肽外，還含有鋅、銅、錳、鐵等多種微量元素［10］。研究表明，該植物中的一些化合物與活血作用相關(guān)，其中益母草堿和水蘇堿有非常顯著的降血黏作用，同時(shí)益母草堿中的胍基結(jié)構(gòu)可抗血小板凝聚，常用作質(zhì)控指標(biāo)［11］；二萜類成分前益母草素是一種血小板活化因子 （PAF）的拮抗劑，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制血小板上的PAF受體，從而產(chǎn)生抗凝作用［12］；從益母草果實(shí)中分離得到的環(huán)九肽Cycloleonuripeptide E和Cycloleonuripeptide F對(duì)大鼠動(dòng)脈有中等強(qiáng)度的血管舒張作用［13］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)益母草中的歐前胡素、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯、4-羥基苯甲醛（YMC-40）、香草醛和24R-25α-豆甾烷2，6二酮這6種芳香族化合物進(jìn)行體外凝血功能和血小板聚集研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均能延長(zhǎng)大鼠體外血漿凝血酶原時(shí)間 （PT）和活化部分凝血酶時(shí)間 （APTT），其中對(duì)羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯的作用更顯著。另外，以上6種化合物對(duì)大鼠血小板聚集也均有影響。

目前對(duì)藥物作用于血管系統(tǒng)的研究主要集中在血液流變學(xué)、抗凝血和抗血栓方面。血液流變學(xué)的主要指標(biāo)是全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等，其水平的增高是導(dǎo)致血液高黏滯及血栓形成的重要原因。其中，全血黏度增高是血液高黏滯的根本因素，主要與紅細(xì)胞聚集增強(qiáng)有關(guān)，而低切變率下的全血黏度可在一定程度上反映紅細(xì)胞的聚集能力；血漿黏度增高也是導(dǎo)致高黏滯的原因之一，與血漿無(wú)形成分的改變有關(guān)［14］。

益母草注射液能減少紅細(xì)胞、血小板、纖維素和白細(xì)胞在小血管內(nèi)壁中的聚集，并使紅細(xì)胞壓積、全血比黏度低切部分、全血還原比黏度低切部分和黏度指數(shù)顯著降低［15］。血小板和凝血因子在止血和血栓形成過(guò)程中起著重要作用，而血小板是一期止血的基礎(chǔ)，可以給凝血系統(tǒng)活化及凝血酶最終形成提供磷脂表面，在血液凝固中具有重要作用。正常的凝血系統(tǒng)是二期止血的重要保障，PT、APTT、凝血酶時(shí)間 （TT）和纖維蛋白原含量測(cè)定 （Fg）是篩選凝血系統(tǒng)有無(wú)異常的重要指標(biāo)。其中，APTT可顯示內(nèi)源途徑凝血因子的活性，而PT則能反映外源性凝血途徑的活性。本實(shí)驗(yàn)表明，益母草中的歐前胡素、對(duì)羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯能明顯延長(zhǎng)PT時(shí)間，其中后兩者能明顯延長(zhǎng)APTT時(shí)間，說(shuō)明它們對(duì)內(nèi)外源型凝血途徑有明顯的抑制作用。但是，以上3種化合物對(duì)血小板聚集的抑制作用均不明顯。

綜上所述，從益母草中提取的芳香族化合物有一定的抗凝血作用，其中對(duì)羥基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羥基苯基）丙酸酯可能是抗凝血的主要成分，推測(cè)與抑制內(nèi)外源凝血途徑有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。另外，本實(shí)驗(yàn)未涉及血液流變學(xué)方面，故仍需作進(jìn)一步深入研究。參考文獻(xiàn)：

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1573-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.040

2014-08-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81303209）

張 雪（1990—），女，碩士，從事中藥藥理與毒理研究。Tel：15928055651，E-mail：yingshanyu@163.com

*通信作者：彭 成（1964—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。E-mail：pengchengchengdu@126.com