吳晶晶， 李國輝， 王貝貝， 顧 星， 李天祥， 李慶和

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

不同產(chǎn)地苦碟子中活性成分的測(cè)定

吳晶晶， 李國輝， 王貝貝， 顧 星， 李天祥*， 李慶和

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

目的考察不同產(chǎn)地苦碟子中主要活性成分的含有量。方法采用UV-VIS法測(cè)定總黃酮，RP-HPLC法定量測(cè)定腺苷、木犀草素和芹菜素。結(jié)果總黃酮平均含有量為 （53.498 1±9.397 0）mg/g，其中以河北承德為最高（71.833 0 mg/g）；腺苷平均含有量為 （0.145 1±0.098）mg/g，其中以陜西咸陽為最高（0.326 9 mg/g）；木犀草素平均含有量為 （0.086 0±0.034 275）mg/g，其中以內(nèi)蒙赤峰為最高 （0.155 5 mg/g）；芹菜素平均含有量為（0.006 0±0.003 511）mg/g，其中以陜西咸陽為最高 （0.012 5mg/g）。結(jié)論不同產(chǎn)地苦碟子藥材活性成分含有量差異較大。

苦碟子；產(chǎn)地；總黃酮；腺苷；木犀草素；芹菜素

苦碟子來源于菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance的地上部分，為二年生草本植物。以干燥全草入藥，其味苦、性微寒，具清熱祛火、消炎解毒、涼血消腫、祛瘀止痛、補(bǔ)虛止咳之功效；民間主要用于治療闌尾炎、扁桃體炎、無名腫痛等癥［1］。主要含有黃酮類、腺苷類、三萜類和倍半萜內(nèi)酯類等成分，其中黃酮類和腺苷類為主要活性成分［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦碟子具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂等作用［3-10］。目前，苦碟子的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要考察某單一成分含有量或某一省區(qū)不同產(chǎn)區(qū)的含有量［11-13］；且 《中國藥典》未收錄此藥，其還沒有統(tǒng)一的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。為保證質(zhì)量，可以從多成分、多產(chǎn)地較全面地對(duì)苦碟子進(jìn)行成分定量考察，并進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。本研究以苦碟子主要活性成分總黃酮、腺苷、木犀草素和芹菜素為指標(biāo)，對(duì)全國主要產(chǎn)地天津 （薊縣）、陜西 （咸陽、榆林）、山西（長治、永濟(jì)）、河南 （信陽獅河港、林州、桐柏）、內(nèi)蒙 （赤峰）、遼寧 （丹東）以及河北 （易縣、承德）7個(gè)產(chǎn)區(qū)、12個(gè)不同產(chǎn)地苦碟子地上部分進(jìn)行主要成分定量測(cè)定，為進(jìn)一步研究、開發(fā)苦碟子提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外-可見分光光度計(jì) （上海美普達(dá)有限公司），Alltech 1500系列Q05型高效液相色譜儀 （UV 1000型全波段可編程紫外檢測(cè)器），F(xiàn)A 2104N電子天平 （上海舜宇恒平科技儀器有限公司），SB25-12DJ超聲波清洗機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司），F(xiàn)Z-6050型真空干燥箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 試藥 對(duì)照品蘆丁 （批號(hào)MUST-12040302）；腺苷 （批號(hào)110879-200202）；木犀草素 （批號(hào)MUST-11051001）；芹菜素 （批號(hào)MUST-10031801）購自國家食品藥品檢定研究院。石油醚、磷酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；市售娃哈哈純凈水；蒸餾水。藥材采自12個(gè)產(chǎn)地，原植物經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥副教授鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦碟子總黃酮測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品25.71 mg，置25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得 1.028 4 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）約0.5 g，精密稱定，加90 m L石油醚索氏回流2 h至無色，棄去石油醚，藥渣揮去石油醚，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取50 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心5 min，取上層離心液，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL對(duì)照品溶液于10 mL量瓶中制成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別加入70%乙醇1 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加5%硝酸鋁0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度搖勻，靜置15 min后，以70%乙醇溶液作為參比溶液，照紫外-可見分光光度法 （《中國藥典》2010年版一部附錄VA），在505 nm波長處測(cè)定吸光度。以吸光度對(duì)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果在20.57～71.99μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系?；貧w方程y=12.533 3x-0.007 9（r= 0.999 3）。

2.1.4 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 m L量瓶中，分別加入70%乙醇1 mL，照“2.1.3”項(xiàng)下顯色方法操作，在505 nm波長處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出苦碟子中總黃酮的量。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定6次吸光度。RSD為0.03%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、20、40、 60、 80、 100、 120 min 測(cè)定， 按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，結(jié)果RSD為1.7%，表明供試品溶液顯色后在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取天津產(chǎn)苦碟子樣品6份，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.9%。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知成分含有量天津產(chǎn)苦碟子藥材0.25 g，精密稱定，6份，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液（1.028 4 mg/mL）適量，加90 m L石油醚索氏回流2 h至無色，棄去石油醚，藥渣揮去石油醚，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取50 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心5 min，取上層離心液，精密吸取0.25 mL，置10 mL量瓶中，照“2.1.4”項(xiàng)測(cè)定法項(xiàng)下的方法，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率為103.0%，RSD值為1.5%，見表1。

表1 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for total flavonoids

2.2 苦碟子中腺苷測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（13∶87）；體積流量1 mL/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長260 nm；進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖1。

圖1 腺苷對(duì)照品(A)和樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference adenosine(A)and sam p le(B)

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的腺苷對(duì)照品7.28 mg，置10 m L量瓶中，用純凈水溶解并定容，搖勻，即得0.728 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）約0.2 g，精密稱定，置于5mL量瓶中，精密加入純凈水5 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，在85℃下水浴加熱10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用純凈水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心5 min，取上層離心液，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.728、2.912、5.096、

7.280 、9.460、11.648、13.832 μg/mL。 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)作圖，得回歸方程：y=36 838x-1 683.5，r=0.999 7，表明腺苷在0.728～13.832μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按 “2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算 RSD值為1.1%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取天津產(chǎn)苦碟子樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，并且按 “2.2.1”項(xiàng)色譜條件下每隔1.3 h測(cè)定其峰面積，測(cè)定6次，其RSD值為2.4%，表明樣品在8 h之內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取天津產(chǎn)苦碟子樣品6份，在 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備，按 “2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定峰面積，RSD值為0.8%。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知成分含有量天津產(chǎn)苦碟子藥材0.1 g，精密稱定，6份，分別加入腺苷對(duì)照品溶液（0.728 mg/mL）適量，置于5 mL量瓶中，精密加入純凈水5 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，在85℃下水浴加熱10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用純凈水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心5 min，取上層離心液，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續(xù)濾液即得。在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示平均回收率為100.8%，RSD值為2.4%，見表2。

表2 腺苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for adenosine

2.3 苦碟子中木犀草素與芹菜素測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（2）（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸（0～16 min，52%A；16～25 min，52%～85%A）；體積流量1 m L/min；柱溫為室溫；檢測(cè)波長336 nm；進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖2。

圖2 混合對(duì)照品(C)和樣品(D)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chrom atogram s of m ixed reference substances(C)and sam p le(D)

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量，置于10mL量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得木犀草素0.228 mg/mL、芹菜素0.024 5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取苦碟子粉末 （過60目篩）1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超聲提取30 min，靜置，吸取上清液。重復(fù)以上操作兩次，合并上清液，過濾，減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，稀釋成木犀草素的質(zhì)量濃度分別為2.28、9.12、15.96、22.80、29.64、36.48、43.32μg/mL，芹菜素的質(zhì)量濃度分別為0.245 0、0.857 5、1.470 0、2.082 5、2.695 0、3.307 5μg/mL。按 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積 （y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)作圖，回歸方程：木犀草素y=42 624.570 1x-46 957.087 3，r=0.999 4；芹菜素y=56 975.455 8x-1 437.208 9，r=0.999 0。結(jié)果顯示，木犀草素、芹菜素分別在2.28～43.32 μg/mL、0.245 0～3.307 5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算木犀草素、芹菜素峰面積RSD值分別為0.4%、0.7%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取天津產(chǎn)苦碟子樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，并且按 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件每隔2.5 h測(cè)定其峰面積，測(cè)定10次，其木犀草素、芹菜素RSD值分別為0.6%、2.8%，表明樣品在25 h之內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取天津產(chǎn)苦碟子樣品6份，在 “2.3.3”項(xiàng)下方法制備，按 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定峰面積，木犀草素、芹菜素RSD值分別為1.2%、2.5%。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含有量天津產(chǎn)苦碟子藥材0.5 g，精密稱定，6份，分別加入木犀草素對(duì)照品溶液（0.228 mg/mL）和芹菜素對(duì)照品溶液（0.0245 mg/m L）適量，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超聲提取30 min，靜置，吸取上清液。重復(fù)以上操作兩次，合并上清液，過濾，減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。在 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示木犀草素、芹菜素平均回收率分別為97.1%、99.2%，RSD值分別為2.1%、2.6%，見表3。

2.4 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地苦碟子樣品，按“2.1”項(xiàng)、“2.2”項(xiàng)、“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果見表4。

表3 木犀草素與芹菜素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for luteolin and apigenin

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determ ination resu lts of samples(n=3)

3 討論

3.1 脫脂溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定苦碟子中總黃酮，用索氏提取并脫脂，對(duì)比了三氯甲烷與石油醚的脫脂效果，結(jié)果表明三氯甲烷與石油醚脫脂后，總黃酮的含有量差異不明顯，且三氯甲烷脫脂時(shí)間較長，毒性較大，故本實(shí)驗(yàn)采用石油醚脫脂。

3.2 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定苦碟子中腺苷，考察了回流提取、超聲提取和先超聲后水浴保溫的方法，結(jié)果表明先超聲后水浴保溫方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果較優(yōu)，測(cè)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇先超聲后水浴保溫方法提取苦碟子中的腺苷。

3.3 檢測(cè)波長的選擇 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定苦碟子中木犀草素和芹菜素時(shí)，對(duì)木犀草素與芹菜素分別進(jìn)行了全波長掃描，木犀草素最大吸收波長為348.5 nm和336 nm，芹菜素為335.5 nm，故選擇對(duì)木犀草素和芹菜素均有較好響應(yīng)的波長336 nm作為檢測(cè)波長。

3.4 流動(dòng)相的選擇 在測(cè)定木犀草素和芹菜素時(shí)，先后考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.2%磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)比較，采用甲醇-0.2%磷酸作為流動(dòng)相，基線穩(wěn)定，色譜圖分離效果最好。

3.5 結(jié)果分析 根據(jù)定量測(cè)定結(jié)果可知，其中總黃酮量最高的產(chǎn)地為河北承德達(dá)71.833 0 mg/g，腺苷、芹菜素以陜西咸陽最高，分別為0.326 9 mg/g、0.012 5 mg/g，木犀草素內(nèi)蒙赤峰最高為0.1555 mg/g。不同產(chǎn)地苦碟子藥材中總黃酮、腺苷、木犀草素和芹菜素含有量差異較大，這可能與產(chǎn)地、氣候條件、土壤環(huán)境等條件有關(guān)。

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Determ ination of active constituents in Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance from different grow ing areas

WU Jing-jing， LIGuo-hui， WANG Bei-bei， GU Xing， LITian-xiang*， LIQing-he
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

AIMTo study the contents of active constituents in Ixerissonchifolia from differentgrowing areas.METHODSUV-VISmethod was used to determine the content of total flavonoids，and using RP-HPLCmethod to determine the contents of adenosine，luteolin and apigenin.RESULTSThe average contentof total flavonoids was 53.498 1±9.397 0 mg/g，the highestwas71.833 0 mg/g in Chengde District，Hebei Province；the average adenosine contentwas0.145 1±0.098 mg/g，the highestwas0.326 9 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province；the average luteolin contentwas 0.086 0±0.034 275 mg/g，the highestwas 0.155 5mg/g in Chifeng District，Inner Monglia Area；the average apigenin contentwas 0.006 0±0.003 511 mg/g，the highestwas0.012 5 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province.CONCLUSIONThere are significant differences in contents of active constituents in Ixeris sonchifolia among different growing areas.

Ixeris sonchifoia（Bge.）Hance；growing area；total flavonoids；adenosine；luteolin；apigenin

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1538-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.031

2014-08-22

生多調(diào)查 （環(huán)）：第四次全國中藥資源普查天津試點(diǎn)；天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （10ZCZDSY12400）

吳晶晶 （1989—），女，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量控制與資源開發(fā)研究。Tel：15900259817，E-mail：1056995200@ qq.com

*通信作者：李天祥（1966—），男，博士，副教授，Tel：（022）59596262，E-mail：litianxiang612@sina.com