金艷坤 井曉婷 羅 靖 余 紅 張 雯 張湘燕 葉賢偉

支氣管肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，有資料顯示，肺癌無論是年發(fā)病人數(shù)還是年死亡人數(shù)，均位居全球癌癥首位［1］。肺癌是一種與環(huán)境因素、生活方式及遺傳因素有關(guān)的惡性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與炎性介質(zhì)和某些與癌發(fā)病相關(guān)的基因多態(tài)性有關(guān)，并存在一定的遺傳易感性差異和家族聚集性［2，3］。單核細(xì)胞趨化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1) 是CC 類趨化因子，是一種重要的炎性細(xì)胞因子，參與機體多種炎性反應(yīng)過程，研究表明MCP-1 -2518 基因多態(tài)性可能與惡性腫瘤的易感性相關(guān)［4，5］。目前MCP-1 基因多態(tài)性與肺癌關(guān)系的相關(guān)研究少見。筆者采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)( PCR-RFLP) 技術(shù)進行基因多態(tài)性的檢測，以期發(fā)現(xiàn)MCP-1 -2518 基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性的相關(guān)性。

材料與方法

1.研究對象：選取2013 年3 ～12 月在貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院治療的肺癌患者90 例作為實驗組，其中男性58 例，女性32 例，患者年齡40 ～79 歲，平均年齡57.5±11.3 歲。32 例同期健康體檢者作為對照組，其中男性19例，女性13 例，年齡42 ～76 歲，平均年齡55.7 ±13.1 歲。實驗前所有受試者均簽署知情同意書。兩組受試者均排除嚴(yán)重心血管疾病、肝腎功能不全、自身免疫性疾病、急性或嚴(yán)重慢性感染性疾病等，且相互間無血緣關(guān)系。經(jīng)檢驗，兩組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

2.實驗方法：(1) 實驗標(biāo)本收集 所有研究對象均于清晨空腹抽取外周靜脈血2ml( EDTA 抗凝) ，搖勻后置于-80℃冰箱保存，用于基因組DNA 的提取。( 2) MCP -1 基因多態(tài)性檢測：1) 全血基因組DNA 的提取： 使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，提取的DNA 進行紫外分光光度檢測。2) 引物合成及PCR 擴增：根據(jù)參考文獻［6］，合成引物。上游引物：5' -TTCTCTTCTACGGGATCTGGG -3'，下游引物： 5' - GTCTCTCCTGGCTTTAGTCAT-3'。進行PCR 擴增： 第1 階段94℃3min； 第2 階段：94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環(huán)30 次；第3 階段：72℃5min。3) PCR 產(chǎn)物的檢測、限制性酶切：PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用紫外線凝膠成像系統(tǒng)判定目的條帶。擴增產(chǎn)物用PvuⅡ限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切結(jié)果并成像。

3.統(tǒng)計學(xué)方法：對實驗對象進行Hardy -Weinberg 遺傳平衡檢驗，以了解所收集的標(biāo)本是否具有良好的群體代表性( P＞0.05) 。使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用χ2檢驗對不同兩組間基因型或等位基因分布頻率的差異進行比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基因型或等位基因進行比值比( odds ratio，OR) 及其95%可信區(qū)間( confidence interval，CI) 的計算，OR 表示相對風(fēng)險度。

結(jié) 果

1. MCP -1 -2518A/G 基因多態(tài)性結(jié)果分析：(1) MCP-1 -2518A/G 位點PCR 擴增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果： 擴增目的DNA 片段為466bp。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳證實，在400 ～500bp 之間有一條清晰的電泳帶，說明目的DNA 的PCR 擴增成功( 圖1) 。(2) MCP-1 -2518A/G 位點PCR 產(chǎn)物PvuⅡ酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果： DNA 片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ酶切后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳觀察3 種基因型：AA 基因型僅見1 條466bp 的電泳帶，GG基因型有327bp 和139bp 兩條電泳帶，AG 基因型有466bp、327bp 和139bp 3 條電泳帶( 圖2) 。

圖1 MCP-1 -2518G/A PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 MCP-1 -2518G/A PCR 產(chǎn)物PvuⅡ酶切后電泳圖

2.MCP-1 -2518A/G 多態(tài)性基因型分布在實驗組與對照組的比較： 經(jīng)驗證，基因型在實驗組和對照組的分布頻率符合Hardy -Weinberg 遺傳平衡，具有群體代表性。對照組中AA、AG、GG 基因型的分布頻率分別為：6.2%、46.9%、46.9%； 實驗組中分別為：26.7%、46.6%、26.7%；3 種基因型在兩組間分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( P =0.022，表1) 。經(jīng)χ2檢驗及風(fēng)險性分析得出，AA 基因型個體患肺癌的相對風(fēng)險度高，GG 基因型個體患肺癌的相對風(fēng)險度較低，攜帶A 等位基因的個體患肺癌的相對風(fēng)險是攜帶G 等位基因個體的2.368 倍，A 等位基因在病例組和對照組的分布頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( 表2) 。

表1 實驗組和對照組MCP-1 -2518A/G 基因型頻率Hardy-Weinberg 平衡及組間比較［n( %) ］

表2 基因型和等位基因分布頻率在兩組中的比較［n( %) ］

討 論

單核細(xì)胞趨化蛋白-1( monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1) 是CC 類趨化因子，位于17 號染色體上，包含3 個外顯子和兩個內(nèi)含子，是一種重要的炎性細(xì)胞因子，參與機體多種炎性反應(yīng)過程。目前研究顯示MCP-1 可通過向肺癌組織內(nèi)趨化單核-吞噬細(xì)胞、促進腫瘤血管生成、腫瘤免疫逃逸等途徑影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展［7］。Rovin 等［8］研究發(fā)現(xiàn)在MCP-1 元的調(diào)控區(qū)-2518A/G 位點，存在A -G 堿基突變，即AA、AG、GG 3 種基因型。MCP - 1 -2518A/G 位點突變可能影響MCP -1 的表達而影響腫瘤免疫效應(yīng)，最終影響腫瘤的發(fā)病。多個研究表明MCP-1 基因-2518 位點A/G 多態(tài)性在一定程度上可以影響到腫瘤的遺傳易感性，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［4，5］。盡管MCP-1 及其多態(tài)性與腫瘤關(guān)系密切，但由于腫瘤的類型及地域、種族、環(huán)境及飲食等方面的差異均可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不同，且目前MCP-1 基因多態(tài)性與肺癌關(guān)系的相關(guān)研究少見。

目前認(rèn)為肺癌的發(fā)生與炎性反應(yīng)關(guān)系密切。炎癥部位的細(xì)胞、分子或基因的改變對肺癌的發(fā)生、進展起著重要作用。慢性或持續(xù)性炎癥可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞大量聚集，產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞和趨化因子并引起級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)正常細(xì)胞DNA 氧化損害，激活癌基因，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。近年來研究證實腫瘤微環(huán)境的產(chǎn)生對腫瘤發(fā)生有關(guān)鍵作用。炎性反應(yīng)引起腫瘤微環(huán)境募集大量巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞清除延遲、活性氧物質(zhì)增加，引起腫瘤發(fā)生，微環(huán)境中的生長因子和血管生成因子使腫瘤部位的血管生成，促進腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。肺內(nèi)微環(huán)境改變可激活肺癌發(fā)生的相關(guān)信號通路、導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生。慢性持續(xù)性感染可以引起支氣管-肺泡干細(xì)胞增殖，致肺上皮細(xì)胞癌變，還能使基因組不穩(wěn)定，引起DNA 損傷、癌基因激活或抑癌基因失活［9，10］。

基因多態(tài)性可導(dǎo)致人類患各種疾病的易感性不同，人類MCP-1 -2518A/G 基因多態(tài)性存在種族差異性。曾有報道，墨西哥人和亞洲人群攜帶G 等位基因者較高加索人和非洲人群多［11］。中國臺灣地區(qū)人群MCP-1 -2518 的G 等位基因頻率為52.4%，與已證實的亞洲人群(47%) 和墨西哥人群(47%) 相似，而高加索人群的G 等位基因頻率為29%，而非裔美國人的G 等位基因更低，只有22%［12］。土耳其人A 和G 等位基因的頻率分別為71%和29%、高加索人 為 73% 和 27%、韓 國 人 分 別 為 39.8% 和60.2%［13～15］。

本研究將90 例肺癌患者和32 例健康對照的MCP-1 -2518A/G 基因位點基因型進行檢測，結(jié)果顯示在貴州地區(qū)漢族人群中存在MCP-1 -2518A/G基因多態(tài)性，健康人群的AA、GG、AG 基因型的分布頻率與上述亞洲人群基因分布頻率相似［10，12］；MCP-1 -2518A/G 3 種基因型在實驗組和對照組中頻率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義：在實驗組中AA 基因型的頻率明顯較對照組高，GG 基因型頻率明顯較低，AA 基因型個體患肺癌的相對風(fēng)險度高，GG 基因型個體患肺癌的相對風(fēng)險度較低；A 等位基因在實驗組和對照組的分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) ，即攜帶A 等位基因的個體患肺癌的相對風(fēng)險是攜帶G 等位基因個體的2.368 倍，提示MCP -1 -2518A/G 中A 等位基因可能是貴州地區(qū)漢族人群患肺癌的遺傳易感基因。

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