劉思妤， 盧新華， 譚 斌， 韓 瑛， 谷 彬

(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 郴州423000)

研究表明，活性氧參與了糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，高血糖可以促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管衰老［1］，而血管衰老是增加血管風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要因素，它能加速糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程［2］。高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 得到緩解，這可能是治療糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化的新目標(biāo)［3］。同時(shí)新近研究也發(fā)現(xiàn)活性氧能增加炎癥的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老［4-5］。中藥瓜蔞皮是葫蘆科植物栝樓或者雙邊栝樓等的果皮，有利氣寬胸、潤(rùn)肺化痰的功效，主要用于治痰熱咳嗽、咽痛、胸悶、消渴等疾病［6］。有研究表明，瓜蔞皮提取物能增強(qiáng)清除自由基能力，并且通過(guò)清除自由基，減少NO的滅活，對(duì)糖尿病大鼠有保護(hù)作用［7］。本研究通過(guò)提取瓜蔞皮有效成分，采用高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型探索瓜蔞皮提取物有效成分對(duì)其的影響及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材及細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)用瓜蔞皮購(gòu)自湖南省郴州市老百姓大藥房(經(jīng)湖南省郴州市藥品檢驗(yàn)所黃麗彬副主任中藥師鑒定為葫蘆科植物栝樓干燥成熟果皮。本品性狀邊緣向內(nèi)卷曲，外表面橙紅色或橙黃色，內(nèi)表面黃白色。質(zhì)較脆，易折斷。具焦糖氣，味淡、微酸。薄層色譜鑒別與瓜蔞皮對(duì)照品和對(duì)照藥材相同);HUVECs 購(gòu)自中科院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫(kù)(編號(hào)C-003-5C)。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶購(gòu)自武漢亞法生物技術(shù)公司;DMEM 培養(yǎng)基為Hyclone 公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為浙江杭州四季青公司產(chǎn)品;MTS 購(gòu)自Promega 公司，批號(hào)G1112;活性氧(ROS)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所出品，批號(hào)S0033;β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所出品，批號(hào)C0602;PCR 試劑盒購(gòu)自北京全式金公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermenta 公司;TRIzol 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)10296010;其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.3 儀器 CXK41 熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS);MCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司);熒光酶標(biāo)儀(Thermo 公司);PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 瓜蔞皮提取物的制備 將5 kg 瓜蔞皮粉碎，用70%的乙醇溶解分次冷凝回流，將回流所得溶液濃縮后用三氯甲烷萃取，再將萃取液濃縮至浸膏，即得初提物。采用硅膠柱層析法分離瓜蔞皮的有效成分，經(jīng)過(guò)TLC 法分析選用極性較大的甲醇-三氯甲烷系統(tǒng)作為洗脫劑。收集中間層即得瓜蔞皮有效成分，再將其濃縮回流得有效成分的浸膏，得率為3.16%。將其靜置在空氣流通處，任其自由揮干。分離得到的浸膏用DMSO 配制成貯備液 (50 mg/mL)，DMSO 終濃度控制在0.1%，用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌后使用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)37 ℃飽和濕度、5% CO2條件培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基中，將鋪滿(mǎn)90% 的HUVECs 細(xì)胞用0.25% 的胰蛋白酶消化傳代，均勻接種于12 孔或96孔的培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分組:①正常對(duì)照組，培養(yǎng)液為含葡萄糖5.6 mmol/L 的DMEM;②高糖損傷組，培養(yǎng)液為含葡萄糖30 mmol/L 的DMEM;③瓜蔞皮提取物預(yù)處理組(瓜蔞皮提取物+高糖組)，細(xì)胞在處理前使用終質(zhì)量濃度為12.5、25、50 μg/mL 瓜蔞皮提取物處理1 h，其余處理同高糖損傷組;④高滲組，培養(yǎng)液為含甘露醇30 mmol/L 的DMEM。

2.3 MTS 法檢測(cè)HUVECs 細(xì)胞的存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs 以胰酶消化，收集細(xì)胞，以1 ×105個(gè)/L 的密度接種于96 孔板。孵育24 h 后，用含1% 胎牛血清的培養(yǎng)基同步消化24 h。再根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加20 μL 0.5 mg/mL MTS，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定各孔的OD 值。細(xì)胞存活率(%) =(各實(shí)驗(yàn)組平均OD 值/正常對(duì)照組平均OD值)×100%。

2.4 細(xì)胞衰老SA-β-gal 檢測(cè) 12 孔板培養(yǎng)處理的細(xì)胞，吸除上清液，PBS 洗滌1 次，每孔加入0.5 mL 固定液，室溫固定15 min，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入0.5 mL 染色工作液，37 ℃孵育過(guò)夜，普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，藍(lán)綠色為SA-β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞，衰老率用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100% 表示。

2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) 采用ROS 敏感的熒光探針DCFH-DA 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧。藥物處理后去除上清液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次，使用熒光酶標(biāo)儀在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)ROS 水平。

2.6 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá) 細(xì)胞接種于12 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，加入0.5 mL TRIzol 提取RNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。TNF-α 引物正向序列5＇-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3＇，反 向 序 列 5＇-GCTTGAGGGTTTGCTACAACA-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物144 bp;IL-6 引物正向序列:5＇-ACCCCCAATAAATATAGGACTGGA-3＇，反向序列:5＇-GAAGGCGCTTGTGGAGAAGG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物128 bp;β-actin 正向序列:5＇-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGTGCT-3＇，反向 序 列:5＇-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCTTCTCC -3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為338 bp。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃×2.5 min，而后94 ℃×30 s，60 ℃×30 s，72 ℃×20 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃×7 min 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，QuantityOne 軟件分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間差異采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩組間采用LSD 法，P ＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 MTS 法檢測(cè)HUVECs 在不同質(zhì)量濃度瓜蔞皮提取物作用下的存活率 MTS 比色法檢測(cè)表明，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的瓜蔞皮提取物處理48 h。與正常對(duì)照組比較，高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞后存活率下降，具有顯著差異(P ＜0.01)。與高糖組比較，藥物處理48 h 內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著升高，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率隨著瓜蔞皮提取物藥物劑量的逐漸提高顯著升高 (P ＜0.05 或P ＜0.01)，推斷不同質(zhì)量濃度的瓜蔞皮提取物對(duì)HUVECs 的存活有明顯促進(jìn)作用。見(jiàn)表1。

表1 瓜蔞皮提取物對(duì)HUVECs 存活率的影響(±s，n=6)

表1 瓜蔞皮提取物對(duì)HUVECs 存活率的影響(±s，n=6)

注:與正常對(duì)照組比較，+ P ＜ 0.01;與高糖組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量 OD490值 存活率%空白組 — 0.101 3 ±0.112 4—正常對(duì)照組 — 1.321 9 ±0.071 5 100高糖組 30 mmol/L 0.661 7 ±0.143 8 + 45.91高糖組+瓜蔞皮提取物12.5 μg/mL 0.887 9 ±0.147 3 64.44高糖組+瓜蔞皮提取物 25 μg/mL 1.125 2 ±0.260 8* 83.88高糖組+瓜蔞皮提取物 50 μg/mL 1.186 4 ±0.163 9＊＊ 88.90高滲組30 mmol/L 1.304 5 ±0.092 8 98.57

3.2 瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老SA-β-gal 活性的比較 孵育48 h 后，與正常對(duì)照組比較，高糖組SA-βgal 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高(P ＜0.01)。與高糖組比較，內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞率隨著瓜蔞皮提取物藥物劑量的逐漸提高顯著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。滲透壓對(duì)HUVECs 無(wú)影響。見(jiàn)圖1。

3.3 瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響活性氧能促進(jìn)衰老的發(fā)生，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平觀察到，孵育48 h 后，與正常對(duì)照組比較，高糖組活性氧水平明顯升高(P ＜0.01)。與高糖組比較，內(nèi)皮細(xì)胞活性氧水平隨著瓜蔞皮提取物藥物劑量的逐漸提高顯著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。高滲組活性氧水平與正常對(duì)照組相近(P ＞0.05)。見(jiàn)圖2。

3.4 瓜蔞皮提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，高糖組TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)明顯增加(P ＜0.01)。與高糖組比較，內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平隨著瓜蔞皮提取物藥物劑量的逐漸提高顯著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。高滲組TNFα 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平與正常對(duì)照組相近(P ＞0.05)。見(jiàn)圖3。

4 討論

內(nèi)皮功能障礙是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。有研究表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)衰老特征，如β-半乳糖苷酶陽(yáng)性、端粒酶縮短等［8］。越來(lái)越多的證據(jù)證明，高血糖能加速細(xì)胞衰老［9-10］，衰老的細(xì)胞同時(shí)伴隨著增殖能力的改變。研究顯示，高糖能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老引起血管內(nèi)皮完整性的缺失，導(dǎo)致血管并發(fā)癥［3］。因此本實(shí)驗(yàn)利用高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，探討瓜蔞皮提取物抑制細(xì)胞衰老的作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)顯示，體外培養(yǎng)的HUVECs 在高糖條件下48 h，MTS 檢測(cè)細(xì)胞活力明顯下降，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多。通過(guò)硅膠層析法分離的瓜蔞皮醇提物，與高糖損傷組相比，瓜蔞皮提取物能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降并減少β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞，提示瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老有較好的抑制作用。

圖1 瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老SA-β-gal 活性的影響

圖2 瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧水平的影響

圖3 瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平的影響

氧化應(yīng)激是細(xì)胞損傷重要機(jī)制，其也是衰老的原因之一。研究表明，高血糖促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生，使得活性氧生成增加，這是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷加速內(nèi)皮細(xì)胞的衰老［11］。同時(shí)衰老與促炎癥反應(yīng)狀態(tài)相關(guān)，促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6 等)通過(guò)促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生誘導(dǎo)上皮細(xì)胞衰老［12］。糖尿病血管衰老與炎癥也同樣緊密相關(guān)，糖尿病血管損傷，內(nèi)皮衰老常伴有炎癥的發(fā)生，因此有學(xué)者建議把慢性炎癥作為衰老的生物標(biāo)志物［13］。本實(shí)驗(yàn)顯示，HUVECs 高糖處理48 h，細(xì)胞中活性氧水平、TNF-α和IL-6 mRNA 的表達(dá)顯著升高，這與以往的報(bào)道相一致。大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，瓜蔞皮提取物具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性［14-15］。本研究也顯示，瓜蔞皮提取物顯著減少高糖誘導(dǎo)的ROS 的增加，同時(shí)促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 mRNA 的表達(dá)顯著下降，提示其抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老作用與抗氧化和抗炎作用有關(guān)。

綜上所述，瓜蔞皮提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs 衰老具有抑制作用。其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激和炎癥，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境下的活力有關(guān)。這提示瓜蔞皮提取物可能具有改善糖尿病血管功能障礙的潛在藥用價(jià)值，對(duì)防治糖尿病血管并發(fā)癥有一定意義。

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