王丹丹， 韋英杰*， 景莉君， 賈曉斌， 劉 超

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇省中醫(yī)藥研究院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病院區(qū)，江蘇南京210028）

基于斑馬魚毒/效聯(lián)合評(píng)價(jià)的強(qiáng)骨膠囊抗骨質(zhì)疏松活性與安全性研究

王丹丹1，2， 韋英杰1，2*， 景莉君2， 賈曉斌2， 劉 超3

（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇省中醫(yī)藥研究院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病院區(qū)，江蘇南京210028）

目的用斑馬魚毒/效聯(lián)合模型評(píng)價(jià)強(qiáng)骨膠囊 （骨碎補(bǔ)總黃酮）抗骨質(zhì)疏松活性與初步安全性。方法將受精后3 d的斑馬魚幼魚暴露在對(duì)照組 （0.4%DMSO胚胎培養(yǎng)用水），潑尼松龍組，依替膦酸二鈉組和強(qiáng)骨膠囊組溶液中培養(yǎng)至9 d。采用茜素紅對(duì)斑馬魚幼魚頭部骨骼染色，定量分析骨骼染色區(qū)域；將受精后24 h的健康斑馬魚胚胎置于不同濃度藥物組中，觀察記錄給藥后1至9 d的死亡數(shù)和3 d的斑馬魚幼魚形態(tài)。結(jié)果25μmol/L潑尼松龍能夠成功誘導(dǎo)斑馬魚骨量顯著丟失。與模型組比較，25 mg/L的強(qiáng)骨膠囊及30 mg/L依替膦酸二鈉陽(yáng)性藥均能顯著抑制潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚頭部骨骼染色面積和累計(jì)光密度值的下降；強(qiáng)骨膠囊對(duì)于9 d斑馬魚的半數(shù)致死質(zhì)量濃度LC50為529.87 mg/L，400 mg/L強(qiáng)骨膠囊溶液處理48 h斑馬魚未見明顯臟器中毒，當(dāng)質(zhì)量濃度大于500 mg/L強(qiáng)骨膠囊均導(dǎo)致斑馬魚心臟中毒，出現(xiàn)心膜出血、血細(xì)胞在心區(qū)堆積及囊腫等現(xiàn)象。其最低中毒濃度為有效劑量濃度的20倍。結(jié)論斑馬魚毒/效聯(lián)合模型成功評(píng)價(jià)了強(qiáng)骨膠囊的抗骨質(zhì)疏松活性及其初步安全性。

斑馬魚；強(qiáng)骨膠囊；毒性；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種系統(tǒng)性骨病，其特征是骨量下降和骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為骨的脆性增加，從而增加了骨折的危險(xiǎn)性，骨質(zhì)疏松癥是一種多因素所致的慢性疾病，尤其在老年人中發(fā)生率極高，已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。

將新鮮黃瓜每處理 20個(gè)果用清水洗凈表面污染物，瀝干后去除兩端不可食用部分，切分為5~6 cm的節(jié)段，采用分瓣器六等分為黃瓜條。測(cè)定含水率、可溶性固形物含量（TSSC）、果肉厚度、種腔直徑、果肉色差（L*、a*、b*值）、果皮硬度、果肉硬度、感官指標(biāo)（口感、脆度）和出品率。

近年來(lái)，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物越來(lái)越多，但西藥的長(zhǎng)期應(yīng)用副作用較大使得中藥的應(yīng)用日益廣泛，為了能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)期用藥和減少不良反應(yīng)，有必要在抗骨質(zhì)疏松中藥前期篩選中同時(shí)重視有效性和安全性。

骨碎補(bǔ)為水龍骨科多年生槲蕨類植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根莖，具有補(bǔ)腎、續(xù)傷、壯骨等功效，為歷代常用藥物。骨碎補(bǔ)根莖主要成分為骨碎補(bǔ)總黃酮，在升高骨密度，減輕骨質(zhì)疏松癥骨痛方面有顯著的作用，越來(lái)越多的運(yùn)用于防治骨質(zhì)疏松癥［1-2］。以骨碎補(bǔ)總黃酮為主要成分的中成藥強(qiáng)骨膠囊是防治骨量減少 （腎陽(yáng)虛證）、骨質(zhì)疏松癥的中藥二類新藥［3-4］，臨床上常用于骨脆易折、關(guān)節(jié)疼痛及骨量減少等證候者。

模式生物斑馬魚在用于建立疾病模型，進(jìn)行藥物活性成分的高通量篩選及藥物代謝的研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛［5-7］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)強(qiáng)骨膠囊在斑馬魚胚胎中的安全性作了初步研究，并以斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評(píng)價(jià)強(qiáng)骨膠囊的抗骨質(zhì)疏松活性，以進(jìn)一步證實(shí)斑馬魚模型用于藥物安全性和活性篩選的可行性和合理性，以期為中藥抗骨質(zhì)疏松的有效性與安全性的早期快速評(píng)價(jià)提供思路。

2.2 斑馬魚安全性的初步研究 將收集到的受精卵移入雙純水中，28.5℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h待用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定強(qiáng)骨膠囊 400、500、600、700、800、900 mg/L質(zhì)量濃度組和對(duì)照組（含0.4%DMSO胚胎培養(yǎng)用水），將上面培養(yǎng)24 h的正常胚胎置于不同質(zhì)量濃度的強(qiáng)骨膠囊溶液中，24孔板每孔6個(gè)胚胎，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組18個(gè)胚胎。作用24 h更換1次強(qiáng)骨膠囊溶液，并于施藥后48 h在顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組的主要臟器形態(tài)，觀察并記錄1～9 dpf斑馬魚的死亡數(shù)，將發(fā)育至3 dpf的斑馬魚置于載玻片上，使載玻片上留存少量溶液，待斑馬魚位置擺好后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照［13］。為減少誤差，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 斑馬魚成魚由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，為德國(guó)Tubingen品系。

2.3 數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各組所需數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù) （n=5～7），t-test比較各組差異［10-12］；利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0計(jì)算強(qiáng)骨膠囊對(duì)9 dpf的斑馬魚半數(shù)死亡濃度。

2 方法

3.2 強(qiáng)骨膠囊對(duì)斑馬魚胚胎的安全性 各質(zhì)量濃度組給藥后2～9 dpf的斑馬魚死亡率結(jié)果如圖4所示，強(qiáng)骨膠囊對(duì)斑馬魚 （9 dpf）的 LC50約為529.87 mg/L；資料表明在2～3 dpf斑馬魚胚胎的心血管能夠發(fā)育完成［14］，顯微鏡下觀察，受精后3 d的斑馬魚 （3 dpf）如圖5所示，強(qiáng)骨膠囊400 mg/L質(zhì)量濃度組幼魚未出現(xiàn)異常癥狀，與對(duì)照組沒有差異。強(qiáng)骨膠囊500、600、700 mg/L質(zhì)量濃度組可以觀察到幼魚心臟區(qū)域心包囊腫大，心膜區(qū)有出血現(xiàn)象，血細(xì)胞在心臟區(qū)堆積，斑馬魚對(duì)刺激不敏感，靜臥于孔板底部，隨著質(zhì)量濃度的增大，800、900 mg/L質(zhì)量濃度組幼魚心臟中毒癥狀更加明顯，心跳微弱甚至停止，血液循環(huán)受阻甚至停止，幼魚身體輪廓模糊，皮膚有潰爛跡象。

林雪川和黎永蘭相遇于2012年。在他們共同的老師組織的一次飯局中，兩人相識(shí)，閑聊中才發(fā)現(xiàn)兩人都是觀閣鎮(zhèn)當(dāng)?shù)刂袑W(xué)的校友。

1.2 儀器與試劑 Nikon Aphaphot-2 YS2顯微鏡（日本株式會(huì)社尼康公司）；Canon PowerShot ELPH 300HS（日本佳能株式會(huì)社）；XW-80A微型渦旋混合儀 （上海滬西分析儀器廠有限公司）；生化培養(yǎng)箱 SPX-80（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Mettler ToledoAB135-分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Image pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）；強(qiáng)骨膠囊 （北京岐黃制藥有限公司，批號(hào)121207025）；潑尼松龍 （蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)YK2012020101）；二甲基亞砜 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120331）；依替膦酸二鈉（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 101174-201001）；多聚甲醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100504）；茜素紅 S（鄭州四季化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)Sj20110806）；MS-222（Acros Organics，批號(hào)A0288328）；水為Milli-Q system高純水（美國(guó)Millipore公司）；其余試劑均為分析純。

3 結(jié)果

3.1 強(qiáng)骨膠囊對(duì)抗?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松的作用 受精后9 d的斑馬魚幼魚的各濃度強(qiáng)骨膠囊組頭骨染色的顯微成像圖如圖1所示，與DMSO組相比，25μmol/L潑尼松龍（prednisolone）模型組的骨染色面積和累計(jì)光密度值 （IOD）明顯降低，存在極顯著性差異 （P＜0.01），表明潑尼松龍?jiān)诖藵舛饶軌虺晒φT導(dǎo)斑馬魚骨量減少。與潑尼松龍模型組比較，30 mg/L依替膦酸二鈉（ED）溶液組中骨染色面積和累計(jì)光密度值 （IOD）顯著升高；強(qiáng)骨膠囊組中，隨著強(qiáng)骨膠囊質(zhì)量濃度增加，斑馬魚頭骨礦化面積和IOD值均隨之增加，10 mg/L溶液中斑馬魚頭骨礦化面積和IOD值與潑尼松龍組比較顯著性增加 （P＜0.05），25 mg/L時(shí)，礦化面積和IOD值呈現(xiàn)極顯著性增加 （P＜0.01）；但當(dāng)質(zhì)量濃度增加到50 mg/L時(shí)，礦化面積與模型組無(wú)明顯差異，質(zhì)量濃度增加至 100 mg/L時(shí)，礦化面積降低至模型組之下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2和圖3。結(jié)果說(shuō)明了10 mg/L和25 mg/L的強(qiáng)骨膠囊可對(duì)抗?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松，而高質(zhì)量濃度則無(wú)明顯的壯骨活性。

圖1 斑馬魚（9 dp f）幼魚經(jīng)各溶液處理后腹面頭骨茜素紅染色顯微成像圖Fig.1 Ventral view of zebrafish larvae（9 dp f）treated w ith 0.4%DMSO and Strong Bone Capsules groups

圖2 強(qiáng)骨膠囊對(duì)斑馬魚頭骨茜素紅染色面積的影響（n=5～7，x±s）Fig.2 Effect of Strong Bone Capsules onMineralized area of mean pixel number of zebrafish larvae（n= 5～7，x±s）

2.1 給藥及斑馬魚固定、骨骼染色 挑選健康的受精后3 d的斑馬魚幼魚分成8組置24孔板，每組2孔，每孔8條幼魚，以孵育的方式進(jìn)行培養(yǎng)給藥［8］，分為0.4%DMSO陰性對(duì)照組、25μmol/L潑尼松龍模型藥物組、30 mg/L依替膦酸二鈉溶液（含25μmol/L潑尼松龍）陽(yáng)性藥物組和1、10、25、50和 100 mg/L強(qiáng)骨膠囊溶液 （均含 25 μmol/L潑尼松龍）組，所有溶液均用培養(yǎng)基［9］進(jìn)行稀釋配制。每孔加入各溶液2 mL，放入28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換1 ML溶液，培養(yǎng)至受精后9 d。由于斑馬魚體內(nèi)卵黃囊含有豐富的營(yíng)養(yǎng)可支持其存活9～10 dpf（days post fertilization）。用MS-222麻醉處死，每孔用4%多聚甲醛溶液固定過(guò)夜，依次按照本課題組前期處理方法進(jìn)行3% H2O2漂白、1%KOH配制的茜素紅溶液染色、不同比例1%KOH和甘油的混合溶液透化等步驟，最后將幼魚保存于純甘油中。將幼魚置于載玻片上擺好位置，使背面向上，用顯微鏡和相機(jī)采集圖像，圖像放大倍數(shù)為10×10。對(duì)拍攝的染色圖片做好標(biāo)記采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計(jì)算頭部骨骼染色面積和累積光密度［10-12］。

綜上所述，在白內(nèi)障小切口手法超乳術(shù)中予以患者優(yōu)質(zhì)護(hù)理，可縮短手術(shù)時(shí)間，優(yōu)化視力恢復(fù)程度，降低并發(fā)癥發(fā)生率，提升護(hù)理滿意度，效果可觀。

圖3 強(qiáng)骨膠囊對(duì)斑馬魚頭骨茜素紅染色累計(jì)光密度的影響（n=5～7，x±s）Fig.3 Effect of Strong Bone Capsules on integrated optical density（IOD）of mean pixel number of zebrafish larvae（n=5～7，x±s）

圖4 強(qiáng)骨膠囊各質(zhì)量濃度組溶液處理后斑馬魚（2～9 dpf）死亡率Fig.4 Mortality of zebrafish（2-9 dpf）treated w ith 0.4%DMSO and Strong Bone Capsules groups

圖5 強(qiáng)骨膠囊對(duì)受精后3 d的斑馬魚幼魚 （3 dpf）的心血管形態(tài)的影響。Fig.5 Effects on morphology of zebrafish（3 dp f）treated w ith 0.4%DMSO and Srong Bone Capsu les groups

4 討論

作為一種新型的脊椎模式動(dòng)物，斑馬魚最初主要用于發(fā)育和遺傳學(xué)研究中。由于斑馬魚胚胎透明，藥物對(duì)其體內(nèi)器官的毒性作用可以直接被觀察到，比如血液循環(huán)以及心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變［13］。此外，斑馬魚胚胎期的發(fā)育特點(diǎn)也特別適合藥物的心血管安全性研究［15-16］。本實(shí)驗(yàn)用這一模型進(jìn)行了市售藥物強(qiáng)骨膠囊的初期心血管短期內(nèi)安全性的研究，關(guān)于長(zhǎng)期和慢性方面的安全性有待進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)表明斑馬魚幼魚頭骨發(fā)育包含骨形成和骨吸收的較完整體系［17］，由于體外細(xì)胞和整體哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在有諸多限制，在國(guó)外，斑馬魚骨質(zhì)疏松模型已漸被作為較為成熟的一種介于單二者之間的在體模式動(dòng)物模型用于藥物（如licochalcone A）抗骨質(zhì)疏松作用評(píng)價(jià)［18］，本實(shí)驗(yàn)室課題組近些年也做了大量的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型篩選壯骨藥物的研究，均取得了良好的預(yù)期效果［10-12］。

這樣學(xué)生可以將之前所學(xué)的內(nèi)容融合到本課的寫作之中，學(xué)生既復(fù)習(xí)了之前的知識(shí)，又有了寫作的方向，寫作的難度就得到了分解，有利于學(xué)生寫作能力的提高。

相關(guān)大鼠骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯亢团R床數(shù)據(jù)表明強(qiáng)骨膠囊具有抗骨質(zhì)疏松的藥理作用［19-20］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，斑馬魚模型成功評(píng)價(jià)了強(qiáng)骨膠囊的抗骨質(zhì)疏松活性，數(shù)據(jù)顯示強(qiáng)骨膠囊在25 mg/L具有最為顯著的抗骨質(zhì)疏松活性，在質(zhì)量濃度增加至50 mg/L和100 mg/L時(shí)，頭骨染色面積和累計(jì)光密度值有所降低，表明藥物的壯骨活性不是隨著質(zhì)量濃度增大而效應(yīng)增強(qiáng)的，這可能與藥物在斑馬魚體內(nèi)的吸收和代謝有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。質(zhì)量濃度在500 mg/L及以上對(duì)斑馬魚幼魚的心血管發(fā)育有影響，且隨著質(zhì)量濃度增加，癥狀加重，顯示出抗骨質(zhì)疏松有效劑量濃度與出現(xiàn)中毒癥狀濃度相差近20倍，提示強(qiáng)骨膠囊治療骨質(zhì)疏松的臨床劑量范圍內(nèi)是安全的，與現(xiàn)有動(dòng)物模型報(bào)道的結(jié)論具有一致性［20-21］。這一模型用于考察藥物毒/效關(guān)系的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究和推廣。

［1］盛 彤，田金洲，胡玉寧，等.強(qiáng)骨膠囊治療原發(fā)性骨量減少 （腎陽(yáng)虛證）的Ⅰ臨床研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，17（7）：413-415.

［2］王和鳴，田金洲，彭淑蓮，等.強(qiáng)骨膠囊治療骨質(zhì)疏松早期骨量減少的臨床觀察［J］.中國(guó)骨傷，2003，16（11）：692-694.

［3］王 林，汪建平.骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2003，18（5）：234-236.

［4］眭承志，樊孝俊，林景雄，等.骨碎補(bǔ)總黃酮治療老年性骨質(zhì)疏松癥 （低轉(zhuǎn)換型）生命質(zhì)量的評(píng)價(jià)［J］.光明中醫(yī)，2012，27（1）：15-20.

［5］舒 斌，韋英杰，張陸勇，等.采用模式生物斑馬魚評(píng)價(jià)三種中藥成分的急性毒性［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（1）：35-37.

［6］韋英杰，賈曉斌，詹 揚(yáng)，等.白楊素在模式生物斑馬魚中的代謝研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（7）：565-568.

［7］韋英杰，王長(zhǎng)梅，蔡雪婷，等.地塞米松影響骨骼發(fā)育的斑馬魚模型的建立［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（2）：255-260.

［8］王長(zhǎng)梅，韋英杰，賈曉斌，等.潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013，15（3）：509-514.

［9］Brand MG，Granato M，Nusslein-Volhard C.Keeping and raising zebrafish［M］.Oxford：Oxford University Press，2002：7-38.

［10］王長(zhǎng)梅，景莉君，韋英杰，等.利用斑馬魚模型評(píng)價(jià)川續(xù)斷皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨質(zhì)疏松活性［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（1）：88-91.

［11］詹 揚(yáng)，韋英杰，王長(zhǎng)梅，等.淫羊藿總黃酮對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚致骨質(zhì)疏松的防治作用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（4）：251-255.

［12］詹 揚(yáng)，韋英杰，王長(zhǎng)梅，等.基于斑馬魚模型評(píng)價(jià)微量淫羊藿苷和朝藿定B的抗骨質(zhì)疏松活性［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2014，49（1）：30-35.

［13］張利軍，史慧勤，苑曉燕，等.多柔比星斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性表現(xiàn)［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（2）：429-432.

［14］Stainier D Y.Zebrafish genetics and vertebrate heart formation［J］.Nat Rev Genet，2001，2（1）：39-48.

［15］Sehnert A J，Huq A，Weinstein BM，etal.Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility［J］.Nat Genet，2002，31（1）：106-110.

［16］張利軍.斑馬魚心臟毒性評(píng)價(jià)模型的建立及美托洛爾心臟毒性作用機(jī)制研究 ［D］.北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2012.

［17］Fleming A，Sato M，Goldsmith P.High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish［J］.J Biomol Screen，2005，10（8）：823-831.

［18］KiMSN，Bae S J，Kwak H B，et al.In vitro and in vivo osteogenic activity of licochalcone A［J］.Amino Acids，2012，42（4）：1455-1465.

［19］謝雁鳴，許勇鋼，趙晉寧，等.骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)去卵巢大鼠骨密度和細(xì)胞因子IL-6、IL-4、TNFα水平的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（1）：34-37.

［20］謝雁鳴，趙普寧，張文軍，等.強(qiáng)骨膠囊抗維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，1998，9（4）：217-220.

［21］謝雁鳴，趙晉寧，李映歐，等.強(qiáng)骨膠囊對(duì)Beagle犬的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)［J］.中藥藥理與臨床，1999，15（5）：29-31.

Anti-osteoporotic activity and safety of Strong Bone Capsules based on joint evaluation of toxicity and effect on zebrafish

WANG Dan-dan1，2， WEIYing-jie1，2*， JING Li-jun2， JIA Xiao-bin2， LIU Chao3
（1.Department of Pharmaceutics，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Key Laboratory of Oral Drug Delivery SysteMof Chinese Meteria-Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Branch of China Academy of ChineseMedical Science，Nanjing 210028，China；3.Endocrine and DiabetesCenter，Jiangsu Province Hospital on Integration of Chineseand Western Medicine，Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science，Nanjing 210028，China）

AIMTo use zebrafish to evaluate the preliminary safety and anti-osteoporosis activity of Strong Bone Capsules（total flavones froMDrynaria fortunei（Kunze）J.Sm）.METHODSZebrafish larvae were coexposed with the vehicle control group（0.4%DMSO），prednisolone group，etidronate disodiuMgroup，and different concentrations of Strong Bone Capsules with 25μmol/L prednisolone froM3 to 9 days post fertilization（dpf）.Zebrafish skeletons at9 dpfwere fixed for stainingwith alizarin red.Quantitative analysis of the stained area was performed.Zebrafish embryos 24 hours post fertilization（hpf）were exposed with various concentrations of Strong Bone Capsules；embryonic morphology of zebrafish（3 dpf）was examined and the death number of the embryos was counted froM2 to 9 dpf.RESULTSThe results indicated that25μmol/L prednisolone could make zebrafish bone loose significantly，and when compared with the model group，25 mg/L Strong Bone Capsules and etidronate disodiuMcould restrain the decline of themineralized area and integrated optical density（IOD）in the head bone.The lethal concentration of 50%（LC50）of Strong Bone Capusles to zebrafish（9 dpf）was 529.87 mg/L；embryos（48 hpf）exposure to 400 mg/L Strong Bone Capsules did not show obvious organ toxicity，while cardiac toxicity of the zebrafish embryo appeared when the concentration was higher than 500 mg/L，such as endocardiuMbleeding，aggregation of blood cells in the chambers aswell as swelling of the heart.TheminimuMtoxic concentration was 20 times of the effective dose.CONCLUSIONThe zebrafish model is successfully used in evaluating anti-osteoporosis activity and preliminary safety of Strong Bone Capsules.

zebrafish；Strong Bone Capsules；toxicity；osteoporosis

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0938-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.003

2014-07-18

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （BK20141507；BK2011866），江蘇省六大人才高峰（2013-YY006），2014年度江蘇省第四期“333工程”科研資助項(xiàng)目 （BRA2014348）

王丹丹 （1986—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。

*通信作者：韋英杰 （1970—），女，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制。Tel：（025）85637809，E-mail：wyj970@163.com