周 莉， 宋益民 ， 唐學(xué)璽

(1. 中國海洋大學(xué)生命學(xué)院，山東 青島266003;2. 青島科技大學(xué)制藥工程系，山東 青島266042)

全蝎是我國傳統(tǒng)的中藥材，有息風(fēng)止痙、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、攻毒散結(jié)等功效，能治療風(fēng)濕痹痛、半身不遂、中風(fēng)、瘰疬、無名腫痛、癌癥、頑固性皮膚病、腎炎、血管硬化、乙肝、脈管炎、血栓閉塞等，其有效藥用成分是蝎毒，迄今為止，從蝎毒中可鑒定出的活性多肽和酶多達(dá)幾十種，但在醫(yī)藥上真正具有確切療效的多肽僅限于抗栓肽、抗癲癇肽、鎮(zhèn)痛肽和抗腫瘤肽等幾種成分［1-2］。蝎毒活 性 肽 (scorpion venom bioactive polypeptide，SVAP)是我室首次報(bào)道的從東亞鉗蝎蝎毒中分離出的一種分子量為7.2 kDa 具有明顯抗栓作用的活性成分，以往的研究工作證明SVAP 抗栓機(jī)制可能與影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)，前列環(huán)素(PGI2)、NO，糾正PGI2/TXA2失調(diào)，提高血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)mRNA 表達(dá)水平，穩(wěn)定血管內(nèi)環(huán)境，擴(kuò)張血管，抗血小板聚集、降低血液黏滯度和改善微循環(huán)有關(guān)［2-6］，但SVAP 抗栓的血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)蛋白分子機(jī)制尚不清楚。本研究針對(duì)高濃度(超生理劑量)同型半胱氨酸(Hyperhomocysteine，HHcy)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷這一血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從VEC 損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的變化與SVAP 干預(yù)等方面進(jìn)行研究，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過比較給藥前后VEC 蛋白表達(dá)的整體改變，對(duì)該細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法條件進(jìn)行優(yōu)化，找出可能介導(dǎo)SVAP 抗栓作用的生物分子、作用靶點(diǎn)，旨在闡明HHcy 引起VEC 損傷致血栓形成的蛋白表達(dá)譜的變化及SVAP防治VEC 損傷、抗血栓形成的蛋白水平分子機(jī)制，并在一定程度上為臨床應(yīng)用SVAP 防治心腦血管血栓栓塞性疾病提供藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 新生兒臍帶取自正常分娩或剖宮產(chǎn)胎兒;24 孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板，25 cm2培養(yǎng)瓶(美國Costar 公司產(chǎn)品);M199 (美國Gibcobrl 公司產(chǎn)品);內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(德國Boehringer Mannheim 產(chǎn)品);1 ∶250 胰酶(北京華美公司產(chǎn)品);M199 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司產(chǎn)品);胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品);L-谷氨酰胺(美國Sigma公司產(chǎn)品);青霉素(新華魯抗藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品);鏈霉素(華北制藥華勝有限公司產(chǎn)品)。固相pH 梯度(immobiline pH gradient，IPG)干膠條(pH 3 ～10 NL，24 cm)、IPG buffer、尿素、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)記物、甘油、十二烷基磺酸鈉(SDS)溴酚藍(lán)購自美國GE Healthcare公司;DBP (分析純，比重l g/mL)、硫脲、3-［(3-膽酰胺丙基)-二乙胺］-丙磺酸(CHAPS)、RNA 酶和DNA 酶、碘乙酰胺(IAA)和甲醛購自美國Sigma 公司;考馬斯亮藍(lán)G250、硫代硫酸鈉、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自美國Amresco 公司;二硫蘇糖醇(DTT)購自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶購自美國Promega 公司;多肽校正標(biāo)準(zhǔn)和基質(zhì)(α-HCCA)購自德國Bruker 公司。

1.2 儀器 IPGphorTM 等電聚焦儀、Hoeter SE600垂直電泳系統(tǒng)、ImageMasterTM2D Platinum software(美國Amersham Pharmacia 公司)，Umax image scanner (Umax 公司)，基質(zhì)輔助激光解析電離化/飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)購自德國Bruker公司。CO2培養(yǎng)箱 (美國Format Scientific Co 產(chǎn)品);Multiscan 酶標(biāo)儀(日本Epson 公司產(chǎn)品);倒置相差顯微鏡(中國上海顯微鏡廠產(chǎn)品);MDF-35 型冷凍干燥機(jī)(日本宮川資材株式會(huì)社產(chǎn)品);高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI 公司產(chǎn)品);FA 2004 型電子天平(上海天平儀器廠產(chǎn)品)。

1.3 藥物制備 SVAP 由本室自制，PBS 溶解后，經(jīng)脫鹽、濃縮、真空冷凍干燥，用無胎牛血清的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液配成一定濃度的溶液，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌條件下取產(chǎn)后新鮮臍帶10 ～15 cm，參考文獻(xiàn)［7］并加以改良，用酶消化法分離臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在濕潤培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%CO2)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含200 mL/L 胎牛血清(SCS)、2 mmol/L 谷氨酰胺、50 mg/L 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、5 μ/mL 肝素的M199，經(jīng)3 ～4 d 待細(xì)胞融合成單層，按1 ∶2 比例傳代培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定，倒置顯微鏡下觀察可見HUVEC貼壁生長、呈鋪石樣鑲嵌排列，細(xì)胞為扁平多角型，核為圓形或橢圓形。試驗(yàn)所用細(xì)胞為2 至3 代。

1.5 蛋白樣品制備與含有量測(cè)定 收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期的HUVEC 傳代接種入75 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞80%以上融合后，將細(xì)胞分為3 組，即空白對(duì)照組、HHcy、HHcy + SVAP 處理組。處理組加入終濃度為500 μmol/L 的HHcy 和10 mg/L SVAP，而空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理繼續(xù)培養(yǎng)6 h，加胰酶消化，吹打，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2 次，加入蛋白質(zhì)酶抑制劑和細(xì)胞裂解液(40 mmol/L Tris、4% CHAPS、8 mol/L 尿素)，液氮凍融3 次，加入RNA 酶和DNA 酶消化核酸，高速離心(16 000 r/min，30 min)收集上清液，得到細(xì)胞總蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)定量采用Bradford 法。

1.6 雙向電泳 分別取空白對(duì)照組、HHcy、HHcy+SVAP 組細(xì)胞的等量蛋白質(zhì)(1 mg)，參考文獻(xiàn)［8］ 并加以改良，用水化液(8 mol/L 尿素，2% CHAPS，13 mmol/L DTT，0.5% IPG buffer，0.002%溴酚藍(lán))定容到450 μL，制成第一向等電聚焦體系，采用膠內(nèi)泡漲的方法上樣，20 個(gè)樣品被加到6 條pH 3 ～10 的非線性膠條中，等電聚焦的參數(shù):30 V 12 h;500 V 1 h;1 000 V 1 h;8 000 V 8 h，等電聚集后，膠條于平衡液1 (1%DTT，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30% 甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍(lán))、平衡液2 (4% 碘乙酰氨，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍(lán))中各平衡15 min，然后轉(zhuǎn)移到第二向已制好的12.5% SDS 膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進(jìn)行第二向電泳，電泳參數(shù)設(shè)定為30 W 45 min;90 W 6 h，直到溴酚藍(lán)染料遷移至膠的底部邊緣，結(jié)束電泳。

1.7 圖像分析 考馬斯亮藍(lán)染色6 h，脫色12 h。Image Scanner 掃描儀掃描染色凝膠后，利用Imagemaster 2D Elite 4101 圖像分析軟件分析電泳圖譜。3 次提取的3 組蛋白質(zhì)，分別進(jìn)行3 次二向電泳，圖像分析時(shí)將HHcy 處理組的凝膠作為參考膠分別與對(duì)照組和HHcy +SVAP 組膠相匹配，蛋白點(diǎn)歸一化定量后輸出數(shù)據(jù)到Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 酶切和質(zhì)譜分析 選取3 次重復(fù)2D 膠上均存在，且差異明顯、無明顯拖尾、且完全分離的點(diǎn)，用刀片沿斑點(diǎn)染色邊緣切下蛋白點(diǎn)，將蛋白膠粒均勻切碎，置于1.5 mL Ep 離心管中，用去離子水清洗2 次，加脫色液(25 mmol/L 碳酸氫銨和50%乙腈)100 μL，搖床震蕩20 min，棄去溶液，重復(fù)3 次，直至膠片中藍(lán)色脫盡，加純乙腈脫水，真空離心干燥。加10 μL 胰酶，4 ℃保溫18 h，加入5%三氟乙酸120 μL 于37 ℃保溫1 h，吸出上清液，加入2.5%三氟乙酸和50%乙腈溶液120 μL于30 ℃保溫1 h，合并上清液冷凍干燥。用5 μL 0.1%三氟乙酸溶解樣品，與1 μL 基質(zhì)(α-腈基-4-羥基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的飽和溶液)充分混勻后，取1 μL 于不銹鋼點(diǎn)靶儀上點(diǎn)樣，風(fēng)干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.9 數(shù)據(jù)庫查詢 將獲得的肽質(zhì)量指紋譜(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心完成)運(yùn)用Mascot 軟件搜索Swissport (http:∥www. matrixscience.com)和NCBInr (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/edd/wrpsb. cgi)數(shù)據(jù)庫，對(duì)質(zhì)譜分析鑒定的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

1.10 Western blot 制備SDS-PAGE 凝膠，β-actin為內(nèi)參，每個(gè)樣品蛋白上樣量為60 μg。在濃縮膠中電泳用80 V 電壓，分離膠則用120 V 電壓，至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)，停止電泳。電轉(zhuǎn)法4 ℃下恒流250 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h，將目的蛋白條帶從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加一抗(1 ∶1 000 錳超氧化物歧化酶抗體;1 ∶10 000 β-actin 抗體)4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光顯色，照相。Tanon 2500 凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像并對(duì)目的蛋白條帶與內(nèi)參灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示。

2 結(jié)果

2.1 HHcy 損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的變化提取血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白，對(duì)空白對(duì)照組、HHcy、HHcy+SVAP 組內(nèi)皮細(xì)胞蛋白進(jìn)行雙向電泳，其代表性考馬斯亮藍(lán)染色電泳圖譜見圖1，Imagemaster 2D Elite 4101 軟件分析結(jié)果表明，平均每塊凝膠上可找到600 個(gè)左右蛋白點(diǎn)，以空白對(duì)照組中一塊凝膠作參照，其蛋白點(diǎn)匹配率為89%，HHcy 組蛋白點(diǎn)匹配率為87%，HHcy +SVAP 組匹配率為86%，說明具良好的重復(fù)性。

2.2 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析 選取有明顯改變(差異4 倍以上)的蛋白點(diǎn)，膠內(nèi)酶切提取蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，與空白對(duì)照組比，HHcy 組發(fā)現(xiàn)有1個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)及11 個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)，這些蛋白涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、核酸、糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝及能量代謝等生物學(xué)過程。與HHcy 組比較，SVAP 可調(diào)節(jié)錳超氧化物歧化酶、網(wǎng)鈣蛋白1 前體和鈣網(wǎng)蛋白前體的蛋白表達(dá)。其中錳超氧化物歧化酶、網(wǎng)鈣蛋白1 前體的表達(dá)上調(diào)，鈣網(wǎng)蛋白前體的表達(dá)下調(diào)。見圖2 ～4、表1。

圖1 體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞雙向電泳圖譜Fig.1 2D maps of proteins from normal，HHcy and HHcy+SVAP treated HUVECS

表1 差異蛋白點(diǎn)基質(zhì)輔助激光解析電離化/飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.1 Indentification results of different protein spots by MALDI-TOF-MS

圖2 體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞錳超氧化物歧化酶蛋白表達(dá)的變化Fig.2 Changes of superoxide dismutase ［Mn］protein expression in HUVEGs in vitro

3 討論

圖3 體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)鈣蛋白1 前體蛋白表達(dá)的變化Fig.3 Changes of reticulocalbin 1 precursor protein expression in HUVECs in vitor

心腦血管血栓栓塞性疾病發(fā)病率甚高，研究其防治措施為世人所矚目。目前，抗栓或溶栓治療被視為有效的防治手段，但目前臨床推薦使用的抗血栓藥物對(duì)心腦血管疾病有很好的防治效果，但不良反應(yīng)明顯，限制了其在臨床上長期反復(fù)使用，如常用的溶栓藥鏈激酶易引起出血，而t-PA 及其突變體價(jià)格昂貴，病人又難以承受。以血管內(nèi)皮細(xì)胞為作用靶點(diǎn)的抗栓藥不同于傳統(tǒng)的抗血栓藥物，既不直接影響凝血系統(tǒng)和血小板功能，也不是直接的溶栓作用。通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，達(dá)到抗血栓目標(biāo)，是目前抗血栓藥物研究發(fā)展的方向。

SVAP 是具有明顯抗栓作用的從蝎毒中分離純化的一種活性成分，以往的研究工作證明SVAP 抗栓機(jī)制可能與影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌t-PA、PAI、PGI2、NO，糾正PGI2/TXA2失調(diào)，提高TM mRNA表達(dá)水平，穩(wěn)定血管內(nèi)環(huán)境，擴(kuò)張血管，抗血小板聚集、降低血液黏滯度和改善微循環(huán)有關(guān)［2-6］，但SVAP 抗栓的血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)蛋白分子機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用2-DE 結(jié)合MALDI-TOF-MS 技術(shù)，分析了體外培養(yǎng)空白對(duì)照組與HHcy 組內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)其中存在12 種差異蛋白，其功能涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝及能量代謝等生物學(xué)過程。表明氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了SVAP 對(duì)空白對(duì)照組與HHcy 組差異表達(dá)蛋白的調(diào)節(jié)作用，探索SVAP 改善血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等作用，結(jié)果表明，SVAP 可調(diào)節(jié)錳超氧化物歧化酶、網(wǎng)鈣蛋白1 前體和鈣網(wǎng)蛋白前體的蛋白表達(dá)。其中錳超氧化物歧化酶、網(wǎng)鈣蛋白1 前體的表達(dá)上調(diào)，鈣網(wǎng)蛋白前體的表達(dá)下調(diào)。且Western blot 與MALDI-TOF-MS 研究結(jié)果相一致。

目前，國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域眾多學(xué)者［9-10］普遍認(rèn)為機(jī)體內(nèi)存在兩類抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶系和非酶系抗氧化防御系統(tǒng)，正常狀態(tài)下內(nèi)源性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可被這兩類氧化系統(tǒng)清除，ROS 的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，酶抗氧化系統(tǒng)主要有錳超氧化物歧化酶、血紅蛋白過氧化物酶、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等，錳超氧化物歧化酶能催化生物體內(nèi)多余的并對(duì)細(xì)胞有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，過氧化氫隨后被體內(nèi)的過氧化氫酶和過氧化物酶分解為H2O 和O2，從而解除O-2所造成的氧化脅迫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，HHcy 中錳超氧化物歧化酶的表達(dá)量較低，機(jī)體產(chǎn)生的ROS 不能及時(shí)得到分解，造成機(jī)體氧自由基平衡失調(diào)，推測(cè)可能是HHcy 狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞酶抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力降低，引起氧化應(yīng)激從而造成內(nèi)皮損傷。同時(shí)SVAP 能夠顯著升高HHcy 血管內(nèi)皮細(xì)胞錳超氧化酶歧化酶的量，顯著增強(qiáng)抗氧化能力，調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激酶的量，表明SVAP 可能通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力而抗氧化應(yīng)激，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

鈣網(wǎng)蛋白前體是一種多功能蛋白質(zhì)，主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔和細(xì)胞核內(nèi)，作為一種主要的鈣離子結(jié)合(儲(chǔ)備)蛋白又稱鈣結(jié)合蛋白3。鈣網(wǎng)蛋白前體的氨基端可與糖皮質(zhì)激素受體的DNA 結(jié)合區(qū)域結(jié)合從而抑制糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素結(jié)合而發(fā)揮作用，因此可以認(rèn)為鈣網(wǎng)蛋白前體是控制核激素受體基因的一個(gè)重要調(diào)質(zhì)，鈣網(wǎng)蛋白前體與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的的關(guān)系未見文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］。本研究證明HHcy 組鈣網(wǎng)蛋白前體的表達(dá)上調(diào)，我們推測(cè)糖皮質(zhì)激素的大部分作用是由存在于細(xì)胞漿內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而改變靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。糖皮質(zhì)激素的靶細(xì)胞廣泛分布于全身器官組織細(xì)胞中。它可通過增加脂皮質(zhì)素1 (lipocortin 1)的生成繼之抑制磷酯酶A2(PLA2)活性而抑制炎癥介質(zhì)白三烯(LTs)、前列腺素(PGs)及血小板活化因子(PAF)的生成。糖皮質(zhì)激素還能誘導(dǎo)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶合成，促進(jìn)可引起血管舒張和致痛的緩激肽降解，此外糖皮質(zhì)激素還能誘導(dǎo)炎細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生抗炎作用。而LTs、PGs、PLA2、PAF 和炎細(xì)胞等在高同型半胱氨酸引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷形成中都起到促進(jìn)作用，所以根據(jù)以上糖皮質(zhì)激素的特性，可能鈣網(wǎng)蛋白前體在抑制糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素結(jié)合的同時(shí)，進(jìn)而間接上調(diào)了LTs、PGs、PLA2、PAF 的活性和增加了血管內(nèi)皮炎細(xì)胞浸潤，從而間接地促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HHcy 組鈣網(wǎng)蛋白前體表達(dá)量與空白對(duì)照組比較顯著提高，而HHcy +SVAP 組與空白對(duì)照組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見，在SVAP 處理組，鈣網(wǎng)蛋白前體表達(dá)量下調(diào)，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素結(jié)合作用增強(qiáng)，抑制了炎癥因子的產(chǎn)生，從而緩解了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的形成?？傊?，SVAP 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其調(diào)節(jié)鈣網(wǎng)蛋白前體表達(dá)有關(guān)，至于詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，為此在今后的研究中我們將針對(duì)鈣網(wǎng)蛋白前體與SVAP、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行具體系統(tǒng)的研究。

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