汪 芳， 蕭 偉 ， 王振中， 彭國平， 李存玉， 鄭云楓， 陸 楊， 李紅陽，

(1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京210023;2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港222001)

中藥注射劑的過敏反應(yīng)是最常見的不良反應(yīng)之一［1］。過敏反應(yīng)即變態(tài)反應(yīng)，是外來性抗原物質(zhì)與體內(nèi)抗體間所發(fā)生的一種非正常免疫反應(yīng)，具有明顯的個體差異和遺傳傾向，是一種IgE 水平異常增高的疾病狀態(tài)［2-3］。過敏原一般無法通過色譜法進行分析，只能進行生物活性檢測，常采用酶聯(lián)免疫吸附實驗法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)［4］，然而采用ELISA 檢測大量過敏原樣本的代價較高，難以普及。2010 年版《中國藥典》中收載的注射劑過敏反應(yīng)檢測為豚鼠主動過敏反應(yīng)檢查法，豚鼠腹腔注射藥物以致敏，再靜脈注射進行攻擊，觀察動物豎毛、噴嚏、干嘔、咳嗽、呼吸困難或抽搐、休克、死亡等過敏反應(yīng)癥狀［5］，此法是以豚鼠表觀現(xiàn)象為評價指標，監(jiān)控藥物過敏性，由于多因素的影響，此方法靈敏度不高，難以達到控制致敏程度有多樣差異性過敏原的目標。過敏反應(yīng)過程中會釋放組胺、5-羥色胺等介質(zhì)，本實驗采用常用的過敏陽性藥物卵蛋白及過敏反應(yīng)較為嚴重的魚腥草注射液［6-7］，對《中國藥典》2010 年版中豚鼠過敏方法加以改良，考察致敏豚鼠在攻擊前后血漿中5-羥色胺的含有量變化，計算其升高率，并進行統(tǒng)計學分析，分析組別差異性，以此來探討5-羥色胺監(jiān)控中藥注射劑過敏反應(yīng)的可行性。

1 實驗材料

1.1 動物來源 健康成年豚鼠30 只，雄性，雜色，體質(zhì)量接近，為(300 ±50)g，由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供，許可證號SCXK (蘇)2007-0008，合格證號2027470。

1.2 儀器 Waters510 高效液相色譜儀，Waters 2465 電化學檢測器(美國Waters 公司);EC2000 色譜工作站(大連伊利特分析儀器有限公司);Phd-200A 精密酸度計(上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司);TGL-16C 飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠);Lichrospher C6H6 色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司，柱號為09092401);FZQ-II 型渦旋混合儀 (江蘇泰縣醫(yī)療器械制造廠);DG5033A 酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

1.3 藥品與試劑 氯化鈉注射液(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，批號100730103);卵蛋白(干粉)(Sigma 公司，批號026K5448);水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號0803116)，庚烷基磺酸鈉(J＆K CHEMICALLTD，批號235385);GBD Guinea pig IgE Elisa Kit (美國R＆D 公司，批號H026-09);魚腥草(采于南京郊區(qū)，經(jīng)江蘇省藥品檢驗所胡浩斌教授鑒定為三白草科魚腥草);乙腈(色譜純，Merck 公司);超純水。

2 實驗方法

2.1 供試品配制 卵蛋白溶液:取卵蛋白適量，用0.9%氯化鈉注射液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的卵蛋白溶液。魚腥草注射液:取新鮮魚腥草2 000 g 進行水蒸氣蒸餾，收集初餾液200 mL，進行重蒸餾，收集重蒸餾液約100 mL，加入7 g 氯化鈉及5 g 吐溫-80，混勻，加注射用水至1 000 mL，濾過，灌封，滅菌，即得。

2.2 豚鼠過敏試驗方法 根據(jù)供試品進行動物分組，分別為:氯化鈉注射液組(NS)、卵蛋白組(OVA)、魚腥草注射液組(YXCI)。取雜色豚鼠30 只，體質(zhì)量250 ～350 g，雄性，按《中國藥典》2010 年版附錄ⅩⅧG 中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導原則中過敏反應(yīng)檢查法進行改進，隔日每只每次腹腔注射供試品0.5 mL，共3 次，進行致敏。然后在首次注射后第21 天，由肌肉注射供試品0.5 mL 進行攻擊。于攻擊前以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)麻醉豚鼠，頸動脈取血1 mL，肝素抗凝。肌肉注射供試品0.5 mL 進行攻擊，于攻擊后15 min 和30 min 分別頸動脈取血1 mL，肝素抗凝。血樣2 000 r/min 離心10 min，取上清血漿，-80 ℃冷凍，留備檢測。

2.3 酶免法測定血漿IgE 攻擊前和攻擊后15 min、30 min 豚鼠頸動脈取血，離取血漿，使用前混勻。ELISA 操作步驟:①取出試劑盒平衡至室溫。②反應(yīng)板每孔分別加入20 μL 標準品、20 μL 血漿。③每孔加入100 μL 緩沖液(Zero Buffer)，輕輕混勻30 s，室溫溫育30 min。④洗板:甩盡板內(nèi)液體，用蒸餾水或者洗滌液洗滌反應(yīng)板，并去除水滴(在厚迭吸水紙上拍干)這樣反復洗滌5 次。⑤每孔加入150 μL 酶聯(lián)物(Reagent)，輕輕混勻10 s，室溫溫育30 min。⑥洗板，方法與步驟4 相同。⑦每孔加入100 μLTMB 顯色液，輕輕混勻10 s，置暗處室溫溫育20 min。⑧每孔加入50 μL 終止液(stopsolution)，輕輕混勻30 s，確定藍色變?yōu)辄S色，30 min 內(nèi)在450 nm 處讀OD 值。

2.4 5-羥色胺的測定 取豚鼠血漿100 μL 避光解凍，加入等量甲醇，混勻，渦旋30 s，3 000 r/min 離心10 min，冷凍30min，取出，10 000r/min 離心10min，取上清液進樣檢測。色譜條件:Hedera ODS-2 (150mm ×4.6mm，5 μL，江蘇漢邦科技有限公司，柱號08022009);柱溫25 ℃;流動相為25 mmol/L 磷酸二氫鈉(內(nèi)含0.5mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，3 mmol/L 庚烷磺酸鈉，pH 4.6)-乙腈(85 ∶15)，用前0.45 μm 濾膜真空抽濾，體積流量0.8 mL/min;ISAAC 參比電極，檢測電位0.6 V，進樣量20 μL。

3 結(jié)果

3.1 IgE 測定結(jié)果

3.1.1 線性關(guān)系考察 精密稱取IgE，配成質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160、200、320 ng/mL 進行試驗，以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得IgE 回歸方程為y =0.014 4x + 0.2572 (r2=0.991 1)。結(jié)果表明，IgE 在10 ～320 ng/mL 范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

3.1.2 血漿IgE 酶聯(lián)免疫測定結(jié)果 3 組豚鼠血漿IgE 水平變化見圖1。卵蛋白組攻擊后15 min 豚鼠血漿中IgE 的升高率平均為20.02%，攻擊后30 min 為71.16%，二者平均為45.58%;魚腥草組攻擊后15 min 豚鼠血漿IgE 的升高率平均為15.77%，攻擊后30 min 為56.33%，二者平均為36.05%。卵蛋白、魚腥草注射液所引起的IgE 升高率均高于生理鹽水組9.43%。卵蛋白在攻擊后15 min 豚鼠血漿中IgE 的平均升高率與生理鹽水組有較顯著性差異，P ＜0.05;卵蛋白在攻擊后30 min 豚鼠血漿中IgE 的升高率與生理鹽水組有顯著性差異，P ＜0.001;魚腥草注射液在攻擊后15 min 豚鼠血漿中IgE 的升高率與生理鹽水組無顯著性差異，P ＞0.05;魚腥草注射液在攻擊后30 min 豚鼠血漿中IgE 的升高率與生理鹽水組有顯著性差異，P ＜0.001。

圖1 各組別豚鼠過敏后血漿免疫球蛋白E 升高率/%

3.2 5-羥色胺測定結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察 5-羥色胺的色譜圖見圖2。精密稱取5-羥色胺適量，配成質(zhì)量濃度為30、60、120、240、600、900、1 500 ng/mL 進樣，以標準液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得5-羥色胺回歸方程為y=0.509 4x-4.426 7 (r2=0.996 8)。結(jié)果表明，5-羥色胺在30 ～1 500 ng/mL 范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖2 5-羥色胺色譜圖

3.2.2 血漿5-羥色胺測定結(jié)果 3 組豚鼠血漿中5-羥色胺變化見圖3。卵蛋白與魚腥草注射液攻擊后，豚鼠血漿中5-羥色胺均有不同程度升高，卵蛋白組攻擊后15 min 豚鼠血漿中5-羥色胺升高率平均為16.50%，攻擊后30 min 為59.99%，二者平均為38.24%;魚腥草注射液攻擊后15 min 豚鼠血漿中5-羥色胺的升高率平均為35.63%，攻擊后30 min 為76.31%，二者平均為55.96%;卵蛋白、魚腥草注射液攻擊后5-羥色胺升高率均高于生理鹽水的7.47%。將卵蛋白、魚腥草注射液攻擊后5-羥色胺的升高率與生理鹽水組進行t 檢驗，卵蛋白攻擊后15 min，5-羥色胺升高率與生理鹽水組有顯著性差異，P ＜0.01;卵蛋白攻擊后30 min，5-羥色胺升高率與生理鹽水組有顯著性差異，P ＜0.001。魚腥草注射液攻擊后15 min 和30 min，5-羥色胺升高率與生理鹽水組均有顯著性差異，P ＜0.001。

圖3 各組別豚鼠過敏后血漿5-羥色胺升高率

4 討論

通過對5-羥色胺的檢測條件優(yōu)化，磷酸二氫鈉緩沖鹽-乙腈系統(tǒng)的峰形優(yōu)于醋酸鈉緩沖鹽-乙腈系統(tǒng)，其比例85 ∶15 可以將5-羥色胺與其他成分基線分離且出峰時間合適，最低檢測限基本可以滿足樣品檢測要求。本實驗同時對豚鼠體內(nèi)另一內(nèi)源性過敏介質(zhì)組胺進行了檢測條件的優(yōu)化，通過鄰苯二甲醛在堿性條件下對組胺衍生化，磷酸終止反應(yīng)，磷酸二氫鈉緩沖鹽-乙腈(65 ∶35)，最低檢測限可以達到約20 ng，但豚鼠血漿樣品中組胺水平常低于檢測限，無法進行數(shù)據(jù)分析，故僅對豚鼠血漿中的5-羥色胺水平進行了檢測分析。

圖4 各組別豚鼠過敏后血漿5-羥色胺和免疫球蛋白E 升高率

一般中藥注射劑所發(fā)生的過敏反應(yīng)是由IgE 所介導的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，當機體致敏后再次接觸過敏原會發(fā)生過敏反應(yīng)，導致肥大細胞破裂及嗜堿性粒細胞脫顆粒，從而釋放過敏介質(zhì)［8-10］。通過對IgE 及過敏介質(zhì)5-羥色胺進行檢測，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生過敏反應(yīng)后，IgE 和5-羥色胺均有不同程度的升高，且陽性藥與空白組均有較顯著性差異。對魚腥草注射液攻擊后IgE 升高率和5-羥色胺升高率進行比較檢驗，沒有顯著性差異，均P ＞0.05。卵蛋白和魚腥草注射液致敏后，IgE 和5-羥色胺變化趨勢基本一致，二者曲線相關(guān)系數(shù)r 為0.82，見圖4。由于過敏性介質(zhì)5-羥色胺可以通過高效液相直接檢測，所以用5-羥色胺控制中藥注射劑過敏反應(yīng)可行，既可以提高檢測速度，又能降低檢測成本。

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