栗亞云，陳廷貴，張立偉

化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室 山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，太原 030006

葉綠素用途非常廣泛，可用于醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品色素以及化工等領(lǐng)域［1-4］。在藥用方面，葉綠素是強抗氧化劑，可防止各種氧自由基所致的氧化損害，從而減少DNA 損傷［5，6］;此外，葉綠素還能有效抑制黃曲霉毒素的致癌效應(yīng)，具有顯著的抗癌作用［7，8］;同時葉綠素以及葉綠素銅鈉鹽等還具有抗貧血、抗?jié)?、抗菌、抗病毒、保肝排毒等諸多藥理作用［9］。在化妝品方面，近年來人工合成色素導(dǎo)致皮膚病急劇增加，由合成色素而引起的皮膚功能障礙占43.9%，長期使用會使皮膚對光線敏感，從而導(dǎo)致色素沉著，還伴有皮膚潮紅、丘疹等炎癥現(xiàn)象［10］。在食品色素方面，國內(nèi)由于蘇丹紅事件，合成色素受到嚴(yán)格的限制，美國批準(zhǔn)的合成色素從700 種銳減到了7 種［11］，人們越來越多的開始重視天然色素的研究應(yīng)用。除上述應(yīng)用之外，葉綠素還可應(yīng)用于軍事偽裝和光動力學(xué)治療癌癥等方面［12，13］。

常用的葉綠素的提取方法，主要有以下幾種:丙酮研磨法、溶劑加熱提取法、浸漬壓榨法、超聲波提取法、微波輔助提取法、超臨界流動萃取法和生物工程法等。溶劑提取法最常使用，該方法工藝簡單，但試劑用量大。浸漬壓榨法浸漬時間長，產(chǎn)品得率低，溶劑消耗量也很大。超臨界流體萃取法萃取溫度低、速度快，但超臨界萃取設(shè)備投資費用過高，影響其應(yīng)用推廣。生物工程法步驟多，工作量較大［14］。上述各方法提取所使用的溶劑一般包括乙醇、丙酮、苯、氯仿、乙醚、石油醚等有機溶劑，這些溶劑易燃、易爆、有揮發(fā)性，有的還有毒性，安全性差［2，15，16］。

濁點萃取技術(shù)(Cloud Point Extraction，CPE)，以水代替有機溶劑作為萃取劑，通過加入少量表面活性劑產(chǎn)生濁點現(xiàn)象而實現(xiàn)高效提取［17，18］。連翹葉為木犀科連翹屬植物連翹［Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl］的葉子，連翹作為一種常用中藥，具有抗炎、抗病毒、解熱、抗肝損傷、抑制cAMP 磷酸二酯酶等作用，我國連翹年產(chǎn)量約在7500 噸左右［19，20］，資源豐富，人們在對連翹果實利用的同時往往忽略了葉子的利用，造成資源的極大浪費，因此開發(fā)連翹葉具有重要意義。

本研究首次使用Triton X-114 水溶液作為提取溶劑，結(jié)合超聲波技術(shù)，以連翹葉為例提取葉綠素，取得了成功。該方法打破了長期以來只能使用有機溶劑提取葉綠素的限制，為葉綠素的開發(fā)利用提供了一種經(jīng)濟(jì)、安全、高效、簡便、省時、環(huán)保新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

連翹葉，采于山西大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定為木犀科連翹屬植物連翹的葉子。采樣后，將新鮮連翹葉洗凈、瀝水，攤開放置于陰涼處，陰干，粉碎。

Triton X-114 購買于Solarbio 科技有限公司，95%乙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

微型高速萬能試樣粉碎機(黃燁市齊家榮科學(xué)儀器廠)、OHAUS CP114 電子天平(美國奧豪斯儀器有限公司)、KQ-250 DB 數(shù)控超聲波清洗器(鞏義市英峪予華儀器廠)、SHZ-C 型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)、Varian Cary 50 紫外-可見分光光度計(美國Varian 公司)、10 mm 石英熒光比色皿(江蘇晶禾光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 葉綠素濁點萃取

準(zhǔn)確稱取連翹葉粉末10 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 5%的Triton X-114 水溶液，蓋塞，振蕩混勻，250 W 超聲處理15 min，抽濾，得濾液，將其倒入分液漏斗，靜置分層，去除下層水相，取上層表面活性劑富集相。加入30 mL 95%乙醇以降低體系粘度，用0.45 μm 濾膜過濾除去Triton X-114，將濾液濃縮，得葉綠素浸膏。

取少量葉綠素浸膏溶于95%乙醇，用紫外可見分光光度計對400～800 nm 波段進(jìn)行掃描，然后根據(jù)Amon 公式對葉綠素含量進(jìn)行計算［2］。

1.3.2 單因素考察

1.3.2.1 Triton X-114 濃度的確定

準(zhǔn)確稱取0.5 g 連翹葉粉末6 份，分別置于10 mL 錐形瓶中，依次加入5 mL 濃度為1%、2%、3%、4%、5%、8%的Triton X-114 水溶液，蓋塞，振蕩混勻，250 W 超聲處理15 min，抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容，分別測定其在665 nm 處的吸光度值。重復(fù)3 次實驗。

1.3.2.2 超聲時間的確定

按上述方法，設(shè)定料液比為1∶10，Triton X-114水溶液濃度為4%，分別測定超聲時間為8、10、13、15、18、20 min 時，665 nm 處的吸光度值。重復(fù)3 次實驗。

1.3.2.3 料液比的確定

按上述方法，設(shè)定Triton X-114 水溶液濃度為4%，超聲時間為13 min，分別測定料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15 時，665 nm 處的吸光度值。重復(fù)3 次實驗。

1.3.3 正交試驗設(shè)計

根據(jù)各單因素實驗所得的Triton X-114 濃度、超聲時間、料液比3 個因素的最佳條件，進(jìn)行三因素三水平L9(33)正交試驗，設(shè)計結(jié)果見表1。

表1 正交試驗水平因素Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.4 與傳統(tǒng)溶劑提取法和超聲波提取法比較

準(zhǔn)確稱取0.5 g 連翹葉粉末3 份，置于錐形瓶中，分別按照本實驗提取方法、劉鄰渭等［4］的傳統(tǒng)溶劑提取法和超聲波提取法(以乙醇替代本實驗提取方法中的提取溶劑，其它條件不變)提取葉綠素，提取完畢后，分別將提取液轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容，測定其在665 nm 處的吸光度值。重復(fù)3 次實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素提取物光譜分析

用紫外-可見吸收分光光度計對實驗所得葉綠素提取物進(jìn)行掃描，得紫外可見吸收光譜如圖1。由圖可知提取液在665 nm 處有明顯的吸收峰，610、430、410 nm 處均有吸收峰，與文獻(xiàn)報道葉綠素a 出峰位置一致，因此可判定該提取方法成功地從連翹葉中提取到了葉綠素。本文選用665 nm 處的吸光度值作為進(jìn)一步分析葉綠素提取效率高低的指標(biāo)。

圖1 連翹葉提取物紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-VIS spectrum of F.suspensa leave extract

2.2 單因素篩選結(jié)果

對該提取方法中的Triton X-114 濃度、超聲時間、料液比進(jìn)行各單因素考察，結(jié)果見圖2。由圖2(A)可得，隨著Triton X-114 濃度的增加，吸光度值逐漸升高，但是濃度達(dá)到4%后，吸光度值隨濃度的增加略有降低，所以得Triton X-114 的最佳濃度是4%。當(dāng)Triton X-114 濃度大于4%時，提取率下降的原因是隨著表面活性劑濃度增大，整個提取體系粘度增大，這不利于葉綠素的浸出擴散，故而提取率開始下降。

由圖2(B)可得，隨著超聲時間的延長，吸光度值逐漸升高，但當(dāng)時間達(dá)到13 min 后，吸光度值隨時間的延長有明顯下降趨勢，故最佳超聲時長為13 min。由于超聲波本身的機械和生化效應(yīng)會對葉綠素造成一定的破壞［21］，因此當(dāng)超聲時間過長時，提取率表現(xiàn)為一定程度的下降。

由圖2(C)可知，隨著料液比的增長，吸光度值逐漸升高，但當(dāng)其比例達(dá)到1∶10 以后，吸光度值隨料液化的增加略有降低，因此最佳料液比為1∶10。這可能是因為用相同功率的超聲波輔助提取時，超聲波在較多溶劑的體系中，被溶劑介質(zhì)吸收而衰減的能量較多，使提取出來的葉綠素量減少［22］，當(dāng)料液比達(dá)到一定比例時，該因素的影響開始占主導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致葉綠素的提取率呈下降趨勢。

圖2 Triton X-114 濃度(A)、超聲時間(B)、料液比(C)對葉綠素提取效果的影響Fig.2 Effects of Triton X-114 concentration(A)，ultrasonic time(B)，Solid-liquid ratio(C)on the extraction yield of chlorophyll

2.3 正交試驗結(jié)果

采用Minitab 軟件設(shè)計L9(33)正交試驗，對其結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

從表2 中可知，因素A(Triton X-114 濃度)的K值:K2＞K3＞K1;因素B(超聲時間)的K 值:K1＞K2＞K3;因素C(料液比)的K 值:K2＞K1＞K3;說明最優(yōu)水平為:A2B1C2。在所選因素水平范圍內(nèi)，因素B的極差R 最大，因此超聲時間是主要影響因素;其次是因素C 和A，故各因素對葉綠素得率的影響程度依次為B＞C＞A。

從表3，F(xiàn) 值大小依次為B＞C＞A，與極差分析結(jié)果一致。各因素對實驗結(jié)果均無顯著性影響。因此，濁點萃取法結(jié)合超聲波提取葉綠素的最佳條件為A2B1C2，即Triton X-114 濃度為4%，超聲時間為11 min，料液比為1∶10。

以正交試驗所得最佳提取條件重復(fù)提取3 次，檢測得665 nm 處的平均吸光度值為1.1805，計算得葉綠素平均提取率為6.65 mg/g，詳見表4。

2.4 與傳統(tǒng)方法和超聲波提取法比較討論

按“1.3.4”項方法進(jìn)行實驗，重復(fù)3 次，結(jié)果如表4 所示。從表中可知，該提取方法與傳統(tǒng)工藝相比，平均提取率提高了9.92%，同時該方法具有安全、無污染、經(jīng)濟(jì)、省時、無需加熱、節(jié)約能源等優(yōu)點;與超聲波提取法相比，在相同條件下，平均提取率提高了11.58%。

表4 不同提取方法提取葉綠素比較Table 4 Comparison of different chlorophyll extraction methods

3 結(jié)論與展望

本研究提供了一種新的提取葉綠素的方法。首先，本提取方法以Triton X-114 水溶液為提取劑，具有工藝設(shè)備簡單、不使用揮發(fā)性有毒試劑、安全、環(huán)保、省時、無需加熱、節(jié)約能源、提取率高等優(yōu)點，這為企業(yè)安全、經(jīng)濟(jì)、高效生產(chǎn)葉綠素提供了保證。其次，連翹以果實入藥，但連翹葉大都被棄之不用，造成了資源的極大浪費，本研究從連翹葉中提取葉綠素，為綜合開發(fā)連翹資源打下了基礎(chǔ)。第三，對于含葉綠素莖葉的中草藥，要提取它們的有效成分，首要任務(wù)就是去除葉綠素，本研究為去除連翹葉及其它中草藥中葉綠素提供了一種新手段。第四，該方法適用于從任何含葉綠素的植物的莖和葉中提取葉綠素，且使葉綠素的獲取變得更加容易，這將會促進(jìn)葉綠素在醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品色素以及化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

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