李 嬌，原 琳，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191

蚯蚓，又稱地龍，屬寡毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物門。在我國(guó)入藥已有四千余年的歷史，具有解熱、鎮(zhèn)痙、活絡(luò)、平喘等功效，是一種常見的動(dòng)物藥材［1］。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)蚯蚓含有多種生物活性成分，并且具有多方面的藥理作用和臨床療效，引起了人們的廣泛關(guān)注［2］。目前，研究主要集中在蚯蚓纖溶酶、抗腫瘤蛋白［3］、抗菌肽［4］等成分的提取和純化方面。研究表明，蚯蚓體內(nèi)還含有豐富的抗氧化酶，它們具有重要的生理功能，可以清除體內(nèi)多余的自由基，能夠治療疾病，延緩衰老。

蚯蚓體內(nèi)的抗氧化酶類包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GSH-R)、葡萄糖氧化酶(GOD)等，其中，我室對(duì)蚯蚓中SOD 和CAT 提取的相關(guān)研究已經(jīng)比較成熟［5］。有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫［6］，在各行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。在食品工業(yè)中，GOD 可用于去葡萄糖［7］、脫氧［8］、殺菌、測(cè)定葡萄糖含量等;在醫(yī)藥行業(yè)，GOD 可以用于尿糖試紙，血糖試紙和葡萄糖酸的生產(chǎn)等;在生物方面，GOD 是生物傳感器領(lǐng)域最主要的工具酶［9］。目前，GOD 的提取來源主要有黑曲霉和青霉屬菌株［8］，動(dòng)植物組織中GOD 的含量極其低，未見從蚯蚓中提取純化GOD的相關(guān)報(bào)道。如果從蚯蚓中提取并純化得到GOD，這不僅將拓寬GOD 的來源，并且能夠擴(kuò)展蚯蚓的應(yīng)用范圍，對(duì)蚯蚓的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

在此前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室采用閃式提取法對(duì)鐵皮石斛多糖［10］、羅漢果多酚［11］、柑橘檸檬苦素［12］、羅漢果甜苷［13］等生物成分進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)提取方法相比，在提取時(shí)間，提取效率方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此，從節(jié)能高效方面考慮，本研究采取閃式提取這一新型方法對(duì)GOD 進(jìn)行提取。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用赤子愛勝蚯蚓(Eisenia fetida)由天津蚓福生物科技開發(fā)有限公司提供;羧甲基纖維素CM-22 購(gòu)買自英國(guó)Whatman 公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購(gòu)自上海試劑二廠;GOD 活性檢測(cè)用苯酚和葡萄糖購(gòu)自北京化工廠，4-氨基安替比林和Triton X-100 均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蛋白檢測(cè)用考馬斯亮藍(lán)G-250 購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;其他試劑均從北京化工廠購(gòu)買;全部試劑均為分析純或色譜純等級(jí);實(shí)驗(yàn)過程中所使用雙蒸水由實(shí)驗(yàn)室自己制得。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ArantiTMJ-25 型低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司;SP-756P 型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;JHBE-50S 型閃式提取器，北京金鼐科技發(fā)展有限公司;蛋白分離純化層析柱，上海錦華層析設(shè)備廠;868 型酸度計(jì)，美國(guó)Orion 公司;雙蒸水過濾器，美國(guó)PALL 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蚯蚓的預(yù)處理

取100 g 冷凍新鮮蚯蚓(已洗凈)，剪碎，以1∶4(m/v)的體積加入已預(yù)冷的50 mmol/L pH 4.8 的醋酸緩沖液(1 mmol/L EDTA)，使用閃式提取器進(jìn)行提取(轉(zhuǎn)速5500 rpm，提取兩次，每次30 s，每次間隔5 min)，閃提后使用800 W 超聲提取器提取30 min，凍存(-70 ℃)12 h。凍存液溶化后使用低溫離心機(jī)離心(轉(zhuǎn)速10000 rpm，時(shí)間50 min)，離心得到的上清液為粗酶液，測(cè)定酶活及蛋白濃度。

1.3.2 預(yù)處理?xiàng)l件的正交優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

對(duì)于蚯蚓的預(yù)處理步驟，影響酶活的主要因素有緩沖液的pH 值、固液比、閃提時(shí)間、閃提轉(zhuǎn)速及超聲時(shí)間。為優(yōu)選正交試驗(yàn)的條件及水平，先對(duì)各因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。單因素實(shí)驗(yàn)的因素及水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor experimental design

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)酶活影響較大的因素作為正交試驗(yàn)的考察因素，正交試驗(yàn)的因素水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 GOD 的純化

1.3.3.1 酸沉淀

用醋酸將粗提液的pH 調(diào)至4.5，冰箱中(-20℃)放置15 min，離心(轉(zhuǎn)速10000 rpm，4 ℃，50 min)，離心后取上清，測(cè)酶活，測(cè)蛋白濃度。

1.3.3.2 CM-22

CM-22 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用50 mmol/L pH 4.5 的醋酸緩沖液平衡。酸沉淀后的上清液pH 調(diào)至4.5，上CM-22 柱(2.5 cm×45 cm)，流速2 mL/min，用同緩沖液洗凈。CM-22 吸附柱用0.6 mol/L pH 5.0 醋酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速1 mL/min，收集液即為GOD 粗提液，測(cè)定酶活，蛋白濃度。收集液用2.5 mmol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液透析4 h。

1.3.3.3 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液平衡。透析后的酶粗提液上DEAE-C 柱(1.6 cm×30 cm)，用同緩沖液洗凈，然后用0.6 mol/L 的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，流速1 mL/min，收集液即為GOD 酶液，測(cè)定酶活，測(cè)定蛋白含量。

1.3.4 GOD 活性測(cè)定

［14，15］的方法，反應(yīng)體系為3 mL，其中包含pH 7.0 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，16 mmol/L的苯酚及4 mmol/L 的Triton X-100，7.5 mmol/L 的4-氨基安替吡啉，0.55 mol/L 的葡萄糖溶液以及0.1 mg/mL 的辣根過氧化物酶，上述混合溶液震蕩混勻后，加入0.1 mL 葡萄糖氧化酶溶液，SP-756P 型分光光度計(jì)，于37 ℃、λ=500nm 自動(dòng)記錄隨時(shí)間變化的吸光度值。酶活力單位定義為:在上述條件下，每毫升溶液中每分鐘催化葡萄糖水解產(chǎn)生1 μmol 產(chǎn)物的酶量。比活力定義為:每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。

1.3.5 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，參考文獻(xiàn)［16］，以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線。

1.3.6 熱穩(wěn)定性

在含0.1 mol/L pH7.0 的磷酸緩沖液中，將GOD 酶液分別置于-18、4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴中，保溫2 h，分別測(cè)定酶活性。

1.3.7 pH 值穩(wěn)定性

將GOD 酶液置于0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2～8)、0.1 mol/L 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9～10)、0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)中，4 ℃保溫2 h 后，分別測(cè)定酶活性。

1.3.8 最適溫度

將酶反應(yīng)體系在22～77 ℃下孵育30 min，分別測(cè)定GOD 的活性。

1.3.9 最適pH

將GOD 酶液置于用0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2～8)、0.1 mol/L 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9～10)、0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)配制成的反應(yīng)體系中反應(yīng)，計(jì)算反應(yīng)后酶活。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蚯蚓預(yù)處理的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1.1 pH 值如圖1 所示，當(dāng)緩沖液的pH 值由3.8 升到4.8時(shí)，GOD 的比活上升，隨后下降，但是變化趨勢(shì)不明顯，因此，正交試驗(yàn)時(shí)不考慮此因素。當(dāng)pH 為4.8時(shí)，GOD 的比活最高，因此，閃提時(shí)緩沖液的pH 選為4.8。

圖1 pH 值對(duì)比活的影響Fig.1 Effect of pH value on the specific activity of GOD

2.1.1.2 固液比

圖2 表明，GOD 的比活先隨液固比升高而升高，當(dāng)液固比為4∶1(mL/g)時(shí)，酶的比活達(dá)到最高，隨后下降，且趨勢(shì)明顯，因此，該因素被選為正交試驗(yàn)的考察因素。

圖2 固液比對(duì)比活的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the specific activity of GOD

2.1.1.3 閃提時(shí)間

圖3 表明，隨著閃提時(shí)間的增加，GOD 的比活有升高的趨勢(shì)，當(dāng)閃提時(shí)間達(dá)到45 s 后，比活開始下降，趨勢(shì)明顯，因此閃提時(shí)間可選為正交試驗(yàn)的考察因素。

圖3 閃提時(shí)間對(duì)比活的影響Fig.3 Effect of flash extraction time on the specific activity of GOD

2.1.1.4 閃提轉(zhuǎn)速

如圖4 所示，隨著閃提轉(zhuǎn)速的增加，GOD 的比活略有升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到2800 rpm 后，比活開始下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速由2200 rpm 升高到3500 rpm 的過程中，GOD 的比活變化很小，因此排除此因素，在實(shí)驗(yàn)過程中，選取2800 rpm 為實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)速。

2.1.1.5 超聲時(shí)間

圖5 表明，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，GOD 的比活升高，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min 后，比活開始下降，且整個(gè)過程變化趨勢(shì)明顯，因此該因素可選為正交試驗(yàn)的考察因素。

圖4 閃提轉(zhuǎn)速對(duì)比活的影響Fig.4 Effect of flash extraction speed on the specific activity of GOD

圖5 超聲時(shí)間對(duì)比活的影響Fig.5 Effect of Ultrasonic extraction time on the specific activity of GOD

2.1.2 正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析

如表3 所示，影響蚯蚓GOD 比活的因素主次影響順序?yàn)锳＞B＞C，即固液比＞超聲時(shí)間＞閃提時(shí)間。三個(gè)因素的最佳搭配組合為A3B2C2，即固液比1∶4.5(g/mL)，超聲時(shí)間30 min，閃提時(shí)間45 s，在此條件下，蚯蚓預(yù)處理部分效果最好。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L9(34)experimental design for the extraction of GOD

正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果如表4 所示。料液比對(duì)蚯蚓GOD 的酶活影響比較顯著，而超聲時(shí)間和閃提時(shí)間兩因素對(duì)GOD 酶活的影響相對(duì)不顯著，影響主次順序?yàn)榱弦罕龋鹃W提時(shí)間＞超聲時(shí)間，這與極差分析的結(jié)果有一定不同，不過從數(shù)據(jù)可以看出，閃提時(shí)間與超聲時(shí)間對(duì)GOD 提取的影響顯著性差距不大，因此會(huì)出現(xiàn)分析結(jié)果的差異，以方差分析結(jié)果為準(zhǔn)，即料液比＞閃提時(shí)間＞超聲時(shí)間。

表4 方差分析Table 4 ANOVA of the GOD extraction

2.2 蚯蚓GOD 的純化

GOD 粗酶液經(jīng)酸沉淀后，比活為131.87 mU/mg。CM-22 的洗脫收集液液，比活為368.13 mU/mg。DEAE 柱的洗脫收集液，比活為2684.21 mU/mg，純化倍數(shù)達(dá)到了37 倍，如表5 所示。

表5 蚯蚓GOD 純化結(jié)果Table 5 Purification results of GOD from the earthworm

GOD 的提取純化現(xiàn)狀如表6 所示，GOD 主要來源于青霉與黑曲霉［15，17］，提取純化工藝比較成熟，純化方法包括超濾濃縮、硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素離子交換層析、Sephadex 凝膠過濾純化等，倍數(shù)大約為20～30，回收率約為30%，本實(shí)驗(yàn)中GOD 的純化倍數(shù)達(dá)到了37 倍，回收率達(dá)到了61%，與已知的青霉菌與黑曲霉的純化工藝相比，純化步驟簡(jiǎn)單，回收率高，純化倍數(shù)高，達(dá)到了很好的提取效果。

表6 GOD 的提取純化現(xiàn)狀Table 6 Extraction and purification status of GOD

2.3 蚯蚓GOD 的穩(wěn)定性

2.3.1 GOD 的溫度穩(wěn)定性

如圖6 所示，蚯蚓GOD 在20 ℃時(shí)穩(wěn)定性最好，在4～30 ℃之間具有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，GOD 幾乎喪失全部活性。

2.3.2 GOD 的pH 值穩(wěn)定性

結(jié)果如圖7 所示，蚯蚓GOD 在pH4～7 之間具有良好的穩(wěn)定性(相對(duì)活性在80%以上)，與昆蟲來源的GOD 近似［17］。當(dāng)pH 8 時(shí)，相對(duì)酶活也在60%以上，當(dāng)pH 為2 及pH 大于9 時(shí)，GOD 幾乎完全失活。根據(jù)GOD 對(duì)不同pH 值的敏感性，在實(shí)驗(yàn)過程中，緩沖體系的pH 一直保持在pH4～7 之間。

圖6 蚯蚓GOD 的熱穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of GOD

圖7 蚯蚓GOD 的pH 值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of GOD

圖8 蚯蚓GOD 的最適反應(yīng)溫度Fig.8 The optimal reaction temperature of GOD

2.4 蚯蚓GOD 的最適反應(yīng)溫度

如圖8 所示，GOD 的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，這與青霉菌來源的GOD［17］基本是一致的，當(dāng)溫度低于32 ℃或者高于57 ℃時(shí)，相對(duì)酶活性下降至40%以下。所以，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中檢測(cè)GOD 酶活性時(shí)溫度控制在37 ℃。

2.5 蚯蚓GOD 的最適pH 值

如圖9 所示，GOD 的反應(yīng)活性對(duì)pH 值非常敏感，它的最適反應(yīng)pH 值為7，當(dāng)pH 值大于7 時(shí)，酶活迅速降低，當(dāng)pH 值小于6 時(shí)，相對(duì)酶活降低到60%以下。所以，在檢測(cè)GOD 活性時(shí)，反應(yīng)體系的pH 一定要嚴(yán)格控制為7。

3 結(jié)論

圖9 蚯蚓GOD 的最適pH 值Fig.9 The optimal reaction pH value of GOD

在本研究中，我們利用閃式提取技術(shù)提取蚯蚓葡萄糖氧化酶(GOD)，并采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了閃提及超聲實(shí)驗(yàn)條件，得到的最優(yōu)條件為:固液比1∶4.5(g/mL)，閃提時(shí)間45 s，超聲時(shí)間30 min。

利用柱層析等方法對(duì)蚯蚓GOD 進(jìn)行純化，最終回收率達(dá)到了60.8%，純化倍數(shù)達(dá)到了37.2。本實(shí)驗(yàn)提純的GOD 最適pH 為7，酶在pH4～7 區(qū)間較穩(wěn)定，酶活保持在80%以上，酶最適溫度為37 ℃，溫度升高時(shí)，酶迅速失活，此結(jié)果表明蚯蚓來源的GOD 與真菌來源GOD 在穩(wěn)定性方面具有一定差異性，這對(duì)進(jìn)一步的研究及工業(yè)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。本研究成功從蚯蚓中純化得到GOD，不僅拓寬了GOD 的生物來源，同時(shí)提高了蚯蚓的綜合利用率。

參考文獻(xiàn)

1 Sun XD(孫曉東)，F(xiàn)ang ZH(房澤海).Pharmacological effects and clinical research progress of earthworms.Sci Technol Innov Herald(科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào))，2009，12:2-3.

2 Cheng G(程果)，Xu S(徐晟)，Xiao X(肖湘)，et al.Purification technique and pharmacologic action of active ingredients in earthworms.J Economic Animal(經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào))，2011，15:114-119.

3 Xie JB(謝江碧)，Guo ZQ(郭振泉)，Weng N(翁寧)，et al.Purification，identification and partial characterization of an apoptosis-related serine protease from earthworm.Prog Biochem Biophys(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展)，2003，30:453-459.

4 Yan QL，Zhen JS，Chong W，et al.Purification of a novel antibacterial short peptide in earthworm Eisenia foetide.Acta Biochim Biophysic Sin，2004，36:297-302.

5 Liao Y(廖怡)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Combined extraction of superoxide dismutase and catalase from earthworm Eisenia fetida.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，11:1538-1544.

6 Zhao XF(趙曉芳)，Zhang HF(張宏福).The function of glucose oxidase and its application in animal husbandry.Guangdong Feed(廣東畜牧)，2007，16:34-35.

7 Xu YQ(徐雅琴)，Yang YJ(楊嚴(yán)俊)，Cao RY(曹如燕).Study on removal of glucose in egg white by glucose oxidase.Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2005，31(2):55-58.

8 Liu C(劉超)，Yuan JG(袁建國(guó))，Wang YX(王元秀)，et al.Progress on glucose oxidase.Food Drug(食品與藥品)，2010，12:285-288.

9 Zhang GD(張廣棟)，Luo CX(羅倉(cāng)學(xué)).Biosensor and its application in food industry.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2005，26:133-134.

10 Li J(李嬌)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Flash extraction of polysaccharide from Dendrobium officinale.Chin Med Mat(中藥材)，2013，9:1524-1527.

11 Liu C，Rong YH，Rong L.Flash extraction of polyphenols from fruits of Siraitia grosvenorii.Food Sci，2010，31(22):50-53.

12 Liu J(劉靜)，Liu C(劉燦)，Rong YH(榮永海)，et al.Optimization of homogenate extraction process of limonin via statistical methods.J South China Univ Technol，Nat Sci(華南理工大學(xué)，自科版)，2011，39(9):28-33.

13 Liu Z(劉兆)，Rong YH(榮永海)，Rong L(榮龍).Flash extraction of mogroside from fruits of Siraitia grosvenorii.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2011，23:561-564.

14 Liao JH(廖金花)，Chen Q(陳巧)，Chen QX(陳清西)，et al.Purification and characterization of alkaline Phosphatase from Haliotis diversicolor.J Xiamen Univ，Nat Sci(廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2005，44:272-275.

15 Zhang Q(張茜)，F(xiàn)u WH(傅婉輝)，Kang JH(康勁翮)，et al.Purification and characterization of glucose oxidase from Penicillium amagasakiense.J Xiamen Univ，Nat Sci(廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2009，48:99-102.

16 Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976，72:248-254.

17 Wang ZX(王志新)，Li N(李寧)，Han J(韓軍)，et al.Extraction and purification of glucose oxidase from Aspergillus niger A9.J Chin Inst Food Sci Technol(中國(guó)食品學(xué)報(bào))，2007，7:64-67.

18 Hu YH(胡永紅)，Wang CZ(王琛柱).Glucose oxidase ininsects and its function.Chin Bull Entomol(昆蟲知識(shí))，2009，46:337-342.