梁厚成,馬 挺,龍 潭,張紅兵

·實驗研究·

小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長發(fā)育的變化特點

梁厚成,馬 挺,龍 潭,張紅兵

目的:研究小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長發(fā)育的變化特點。

視網(wǎng)膜電圖;小鼠;生長發(fā)育

引用:梁厚成,馬挺,龍?zhí)?等.小鼠視網(wǎng)膜電圖隨生長發(fā)育的變化特點.國際眼科雜志2015;15(11):1867-1870

0 引言

視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)是視覺電生理檢查項目中的一種,主要可用來檢查視網(wǎng)膜功能,在各種視網(wǎng)膜病變的診治及評估中有著重要的作用。對于兒童視網(wǎng)膜疾病及各種遺傳性視網(wǎng)膜疾病的診治,ERG亦有著重要的作用。然而兒童在出生后,視網(wǎng)膜并未發(fā)育成熟,隨著年齡的增長,視網(wǎng)膜功能方可逐漸發(fā)育成熟,同時由于兒童視網(wǎng)膜中不同種類的細胞發(fā)育速度的不同[1],導(dǎo)致兒童的ERG與成年人相比有著不同的特征。小鼠因其95%以上的基因組與人類相同,并且可快速繁殖,在出生后2mo內(nèi)即可達到性成熟,每胎可產(chǎn)仔8只以上,故其可作為多種疾病的模型動物。本文研究小鼠在發(fā)育過程中ERG的變化過程,以探討小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程及機制,以及遺傳性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療措施。

1 材料和方法

1.1 材料昆明種二級小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心),共50只(50眼),按觀察的周齡分為5組,每組各10只10眼。所有小鼠在自然光線下飼養(yǎng),不限食水。

1.2 方法[2]

1.2.1 實驗儀器使用國特GT-2000NV(重慶國特醫(yī)療設(shè)備有限公司)記錄ERG。刺激器為Ganzfeld全野刺激器。記錄電極為自制Ag-AgCl環(huán)狀角膜電極,參考電極和接地電極分別為不銹鋼自制針狀電極,各電極自身阻抗均小于10Ω。

1.2.2 實驗方案及觀察指標(biāo)所有小鼠睜眼時間均在出生后12～13d。記錄ERG的時間點為出生后14d (Postnatal 14 days,P14)、21d(Postnatal 21 days,P21)、28d (Postnatal 28 days,P28)、35d(Postnatal 35 days,P35)、56d (Postnatal 56 days,P56)記錄ERG[2]。其中P56小鼠記錄ERG作為成年小鼠的數(shù)據(jù)。2h暗適應(yīng)后,使用速眠新(0.5～0.8mL/kg)進行腹腔注射麻醉,同時復(fù)方托品酰胺點檢查眼4次,進行散瞳。在暗紅光條件下放置電極。其中記錄電極貼于角膜表面,并滴加生理鹽水減少阻抗干擾,于左側(cè)頰部皮下置入?yún)⒖茧姌O,同時接地電極置于尾部。電極安放好后,測試干擾在適當(dāng)范圍后,繼續(xù)關(guān)燈暗適應(yīng)5min,依次進行桿體ERG(Rod-ERG)、最大混合反應(yīng)ERG(Max-ERG)、振蕩電位(OPs)的記錄。記錄條件設(shè)置為:均為單次白色閃光刺激,1min間隔。其后在20cd/m2背景光下進行10min明適應(yīng),依次記錄明適應(yīng)ERG(Cone-ERG)、30-Hz閃爍ERG(Flick-ERG)。Cone-ERG為連續(xù)白光閃光刺激,共疊加10次,刺激頻率為2Hz;Flick-ERG刺激光亦為白光,頻率為30Hz,疊加約100次,直至波形平滑為止。Rod-ERG的刺激光強度為1.54×10-2(cd·s)/m2;其他ERG刺激光強度均為2.0(cd·s)/m2。振蕩電位通頻帶為100～300Hz,其余各項均為1～100Hz。Flick-ERG自第2個正向波開始記錄4個波,取其平均值作為其幅值。

統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)的處理使用SPSS 10.0軟件包進行單因素方差分析,并對兩兩間比較使用Dunnett T3分析。數(shù)據(jù)以95%可信區(qū)間表示,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在各周齡間Max-ERG a波、OPs O1波峰潛時及Flick-ERG幅值均無統(tǒng)計學(xué)差異;除P14和P28間Cone-ERG a波峰潛存在統(tǒng)計學(xué)差異外,其他各時間點無統(tǒng)計學(xué)差異;P14與P21、P28的Cone-ERG b波峰潛時分別存在統(tǒng)計學(xué)差異;而P14與其他各時間點間的Cone-ERG b波幅值、OPs O1、OPs O2波峰潛時和波幅值、Rod-ERG b波、Max-ERG b波均存在統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。P14時,其中9只小鼠OPs的峰潛時較成年小鼠明顯延長,而1只小鼠的OPs表現(xiàn)為只有1個波。P21時,OPs形成5～6個波。在生長期間,OPs各波峰潛時逐漸縮短,測量O2波數(shù)據(jù)作為OPs的值(圖1)。在出生后各時間點之間Flick-ERG波幅值無統(tǒng)計學(xué)差異,但波形略有不同(圖1)。

表1 小鼠ERG中部分參數(shù)隨生長發(fā)育的變化

3 討論

ERG是視網(wǎng)膜受到光線刺激后,節(jié)細胞之前各層細胞的電活動。ERG包括5個檢查項目,各檢查項目表示的視網(wǎng)膜細胞成分為:Rod-ERG:視桿細胞系統(tǒng);Max-ERG:所有視桿和視錐系統(tǒng);OPs:內(nèi)核層;Cone-ERG:視錐系統(tǒng)及少量視桿系統(tǒng);Flick-ERG(30Hz):視錐系統(tǒng)。而本研究以此標(biāo)準(zhǔn)對小鼠ERG的發(fā)育變化進行了初步的研究。

視網(wǎng)膜中包含有光感受器細胞、雙極細胞、無長突細胞、Müller細胞等7種細胞,各種細胞發(fā)育成熟的時間并不一致[3]。很多物種視網(wǎng)膜在發(fā)育階段經(jīng)歷兩個階段[4]。早期發(fā)育中,包括錐體細胞和神經(jīng)節(jié)細胞等在內(nèi)的部分細胞首先發(fā)育成熟;而在發(fā)育晚期,大部分的視桿細胞等細胞才發(fā)育成熟。小鼠視網(wǎng)膜[5]的發(fā)育也大致分為兩個時期。從胚胎期第10d(E10)至胚胎期第14d(E14)為早期,而晚期則是從E17持續(xù)至出生后。視桿祖先細胞在有絲分裂停止后的5.5～12.5d,視桿細胞方才表達其特異性抗原Rhodopsin,這提示視桿細胞在出生后仍處于發(fā)育階段[6-7]。另有研究顯示視桿細胞的形態(tài)在出生后仍在發(fā)育,P10時內(nèi)節(jié)已發(fā)育成熟,然而外節(jié)需到P21時才發(fā)育成熟[8]。同時視網(wǎng)膜各種細胞的程序性凋亡對于視網(wǎng)膜發(fā)揮正常的功能是非常重要的[9]。

本實驗中,Rod-ERG b波在P21達到成年水平,而這個時間恰好是視桿細胞發(fā)育成熟的時間。有研究顯示大鼠視桿細胞外節(jié)長度以及Rhodopsin水平與Rod-ERG b波有顯著相關(guān)性[10]。因此Rod-ERG b波可能與視桿細胞、視桿雙極細胞以及無長突細胞有關(guān)。

圖1 小鼠在P14和P56的ERG。

既往的研究顯示,光感受器細胞形成Max-ERG a波。本研究中,Max-ERG a波的峰潛時于P14已達到成年水平,而幅值達成年水平的時間則是P21,這可能提示視桿細胞和視錐細胞在接受光刺激后形成電活動的時間是一致的。Max-ERG b波于P21時達成年水平,而在P14時b波幅值較低。Wurziger等[11]認(rèn)為ERG b波起源于on-雙極細胞和第三級神經(jīng)元(無長突細胞)。

P14時OPs O1波峰潛時已達成年水平,而幅值則于P21方達成年水平,這與Max-ERG a波相似。而OPs第二波群幅值和峰潛時均在P21時達到成年水平,與Max-ERG b波的發(fā)育時間相似。但通常認(rèn)為產(chǎn)生這兩種波形的細胞是不同的。在人類OPs中,各個波亦來自不同的細胞,其中桿體細胞系統(tǒng)可能形成O3和O4波[12-13]。本研究表明O1波達到成年水平的時間要早于第二波群,這亦可間接提示第二波群起源于視桿系統(tǒng),而O1波則起源于視錐系統(tǒng)。

小鼠Cone-ERG無明顯的a波,在出生后各時間點間b波峰潛時無統(tǒng)計學(xué)差異,而在P21時幅值方才達到成年水平。出生后各個時間點間Flick-ERG的幅值無統(tǒng)計學(xué)差異。既往研究顯示產(chǎn)生Flick-ERG的細胞包括雙極細胞以及光感受器細胞[14]。本研究間接證實視錐相關(guān)雙極細胞在P14已經(jīng)發(fā)育成熟,而在P14后視桿細胞繼續(xù)發(fā)育可能導(dǎo)致了Cone-ERG b波幅值在P21方達成年水平。因此無長突細胞及雙極細胞可能是產(chǎn)生Cone-ERG b波的細胞。Flick-ERG的波形在P14與成年時不同,提示視錐系統(tǒng)亦有繼續(xù)發(fā)育的可能。

該研究結(jié)果間接證明了視網(wǎng)膜明視和暗視系統(tǒng)具有不同的發(fā)育時間點[3],并與人類不同發(fā)育時期的ERG相似[1]。本研究顯示昆明種小鼠在不同發(fā)育階段ERG波形不盡相同,在P21時ERG的各項參數(shù)已達到成年時的水平,其中在P14時視錐系統(tǒng)起源波形已達成年水平。因此記錄小鼠ERG需考慮不同發(fā)育階段對波形的影響。

1 Westall CA,Panton CM,Levin AV.Time courses for maturation of electroretinogram responses from infancy to adulthood.Doc Ophthalmol 1998;96(4):355

2張作明,顧永昊,李莉,等.類似先天性靜止性夜盲癥視覺電生理異常大鼠1例.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報2002;23(1):5-7

3 Young RW.Cell differentiation in retina of mouse.Anat Rec 1985;212 (2):199

4 LaVail MM,Rapaport DH,Rakie P.Cytogenesis in the monkey retina.J Comp Neurol 1991;309(1):86

5 Kilpatrick TJ,Bartlett PE.Cloned multipotential precursors from the mouse cerebrum require FGF-2,whereas glial restricted precursors are stimulated with either FGF-2 or EGF.J Neurosci1995;15(5pt1):3653-3661

6 Cepko CL.The patterning and onset of opsin expression in vertebrate retina.Curr Opin Neurobiol1996;6(4):542-546

7 Morrow EM,Belliveau MJ,Cepko CL.Two phases of rod photoreceptor differentiation during rat retinal development.J Neurosci1998;8(10):3738-3748

8 Richard S.Smith.Systematic evaluation of the mouse eye:anatomy, pathology and biomethods.Boca Raton,Florida,CRC Press2002:46-62

9 Mervin K,Stone J.Developmental death of photoreceptors in the C57BL/6J mouse:association with retinal function and self-protection.Exp Eye Res2002;75(6):703-713

10 Fulton AB,Hansen RM,Findl O.The development of the rod photoresponse from dark-adapted rats.Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36 (6):1038-1045

11 Wurziger K,Lichtenberger T,Hanitzsch R.On-bipolar cells and depolarising third-order neurons as the origin of the ERG-b-wave in the RCS rat.Vis Res2001;41(8):1091-1101

12 Janaky M,Goupland SG,Benedek G.Human oscillatory potentials: components of rod origin.Ophthalmologica 1996;210(6):315-318

13 Rousseau S,Lachapelle P.The electroretinogram recorded at the onset of dark-adaptation:understanding the origin of the scotopic oscillatory potentials.Doc Ophthalmol 1999;99(2):135-150

14 Kondo M,Sieving PA.Primate photopic sine-wave flicker ERG: vector modeling analysis of component origins using glutamate analogs. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42(1):305-312

Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina

Hou-Cheng Liang,Ting Ma,Tan Long,Hong-Bing Zhang

Department of Ophthalmology,Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China

Foundation item:Subject of Xi'an Science and Technology Bureau (No.YF07136)

Tan Long.Department of Ophthalmology, Xi'an No.1 Hospital,Xi'an Eye Hospital,Xi'an 710002,Shaanxi Province,China.longtan1@sina.com

·AIM:To investigate the changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina.·METHODS:The ERG of 50 mice(50 eyes)of KUNMING at the ages of postnatal 14d(P14),P21,P28,P35 and P56 were measured respectively.The implicit times and amplitudes of b wave of Rod-ERG,a and b waves of Max-ERG,a and b waves of Cone-ERG and O1 and O2 waves of OPs at different ages,as well as amplitude of Flick-ERG,were compared.·RESULTS:The M ax-ERG a-waves(the 95%CI were 15.00～18.60,12.00～15.00,13.20～14.40,13.20～15.00, 13.20～15.00,respectively),OPs O1(the 95%CI were 15.00～19.80,13.80～18.00,13.20～14.40,13.80～15.60, 13.80～15.60,respectively)waves shared the implicit times at the different stages,and the Flick-ERG(the 95% CI were 0.97～3.28,0.85～2.32,0.91～3.49,0.94～2.68, 0.98～3.69μV,respectively)shared the amplitudes also. There was no significant difference among the weeks(P＞0.05).The implicit times of the Cone-ERG a-waves(the 95%CI were 25.20～55.20,27.00～40.20,27.00～38.40,25. 20～43.80,23.40～37.80,respectively)between P14 and P28 were distinct with statistical difference(P＜0.05).The implicit times of Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 70.80～88.20,56.40～78.60,60.00～75.60,60.60～87.00, 62.40～81.60m s,respectively)at P14 were statistically different from those at P21 and at P28.The implicit times and amplitudes of Rod-ERG b-waves(the 95%CI were 87.00～114.00,53.40～73.80,52.2～63.6,55.20～71.40, 57.60～67.80m s,and 64.21～195.07,133.79～355.71,130. 62～355.96,190.92～448.97,239.26～462.40μV, respectively),Max-ERG b-waves(the 95%CI were 67.20～107.40,32.40～54.60,31.20～36.60,31.80～42.00,34.20～41.40m s,and 160.64～344.48,281.74～590.09,284.91～716.80,358.64～737.55,406.98～810.55μV,respectively), and OPs O2 waves(the 95%CI were 49.8～69.6,29.40～42.60,28.80～33.60,28.80～37.80,31.20～37.20m s,and 5.43～24.84,54.38～147.52,65.55～201.60,46.33～164.79,49.07～148.32μV,respectively)at P14 were different from those at other stages,and the amplitudes of OPs O1(the 95%CI were 11.60～21.36,6.77～53.71, 32.96～76.42,34.06～70.37,35.58～63.35μV, respectively)and Cone-ERG b-waves(the 95%CI were 5.10～15.85,9.61～24.88,14.96～40.73,14.87～28.54, 13.83～51.98μV,respectively)were from those at other stages also,and there were significant differences.The O1 wave of OPs had been present at P14,but the second cluster of OPs of one mouse(1/10)had not been obvious at the same time.·CONCLUSION:The experiment con firm sthat the different waves come from different cells in retina in mice at certain degree.Due to the change of the ERG in the development of mice,so it should be considered that the different development stages will affect the results when measuring the ERG of mice.

electroretiogram;mice;development

西安市科技局課題(No.YF07136)

作者單位:(710002)中國陜西省西安市第一醫(yī)院眼科西安市眼科醫(yī)院

梁厚成,畢業(yè)于第四軍醫(yī)大學(xué),博士,主任醫(yī)師,西安市眼科醫(yī)院院長,研究方向:眼科臨床。

龍?zhí)?畢業(yè)于武漢大學(xué),博士,副主任醫(yī)師,西安市眼科醫(yī)院白內(nèi)障病區(qū)副主任,研究方向:白內(nèi)障.longtan1@sina.com

2015-07-10

2015-10-23

:Liang HC,Ma T,Long T,et al.Changes of electroretinogram in mice with the growth and development of retina. Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1867-1870

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.07

Received:2015-07-10 Accepted:2015-10-23

方法:我們分別測量50只50眼昆明種小鼠在出生后第14、21、28、35和56d視網(wǎng)膜電圖,分析比較各時間點Rod-ERG b波、Max-ERG a及b波、Cone-ERG的a及b波、OPs O1及O2波幅值及峰潛時、Flick-ERG幅值。

結(jié)果:Max-ERG a波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為15.00～18.60、12.00～15.00、13.20～14.40、13.20～15.00、13.20～15.00ms)、OPs O1波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為15.00～19.80、13.80～18.00、13.20～14.40、13.80～15.60、13.80～15.60ms)和Flick-ERG幅值(各時間點95%可信區(qū)間依次為0.97～3.28、0.85～2.32、0.91～3.49、0.94～2.68、0.98～3.69μV)在各周齡間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);Cone-ERG a波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為25.20～55.20、27.00～40.20、27.00～38.40、25.20～43.80、23.40～37.80ms)在出生后14d和28d間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)、出生后14d與出生后21d、28d間Cone-ERG b波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為70.80～88.20、56.40～78.60、60.00～75.60、60.60～87.00、62.40～81.60ms)均有統(tǒng)計學(xué)差異;同時出生后第14d與其他時間點間Rod-ERG b波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為87.00～114.00、53.40～73.80、52.2～63.6、55.20～71.40、57.60～67.80ms)及幅值(各時間點95%可信區(qū)間依次為64.21～195.07、133.79～355.71、130.62～355.96、190.92～448.97、239.26～462.40μV)、Max-ERG b波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為67.20～107.40、32.40～54.60、31.20～36.60、31.80～42.00、34.20～41.40ms)及幅值(各時間點95%可信區(qū)間依次為160.64～344.48、281.74～590.09、284.91～716.80、358.64～737.55、406.98～810.55μV)、OPs O2波峰潛時(各時間點95%可信區(qū)間依次為49.8～69.6、29.40～42.60、28.80～33.60、28.80～37.80、31.20～37.20ms)和波幅值(各時間點95%可信區(qū)間依次為5.43～24.84、54.38～147.52、65.55～201.60、46.33～164.79、49.07～148.32μV)以及OPs O1(各時間點95%可信區(qū)間依次為11.60～21.36、6.77～53.71、32.96～76.42、34.06～70.37、35.58～63.35μV)和Cone-ERG b波幅值(各時間點95%可信區(qū)間依次為5.10～15.85、9.61～24.88、14.96～40.73、14.87～28.54、13.83～51.98μV)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。OPs O1波在P14時即已存在,而有一只小鼠(1/10)OPs第二波群在第2wk時波形不明顯。

結(jié)論:本實驗結(jié)果在一定程度上證實了小鼠ERG中各波形的起源。由于小鼠ERG在發(fā)育過程中的變化,在測量小鼠ERG時應(yīng)當(dāng)考慮到小鼠發(fā)育階段對結(jié)果的影響。