張永強(qiáng)，吳曉東，鄒艷麗，包靜月，王筱真，王志亮

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心/外來動(dòng)物疫病研究中心，山東青島 266032）

一株小反芻獸疫病毒的分離鑒定與生長(zhǎng)曲線測(cè)定

張永強(qiáng)，吳曉東，鄒艷麗，包靜月，王筱真，王志亮

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心/外來動(dòng)物疫病研究中心，山東青島 266032）

將含高滴度小反芻獸疫病毒的新鮮病料研磨后接種VERO DS細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離，出現(xiàn)細(xì)胞病變后連續(xù)傳代，取3代以上培養(yǎng)物，進(jìn)行RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)及生長(zhǎng)曲線測(cè)定。生長(zhǎng)曲線測(cè)定分別以0.01和0.1 MOI接種VERO DS細(xì)胞，每隔12h測(cè)定病毒滴度，連續(xù)培養(yǎng)168h，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，分析生長(zhǎng)特性。結(jié)果顯示，病料接種細(xì)胞72h后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定為小反芻獸疫病毒 ；生長(zhǎng)特性研究顯示，0.01和0.1 MOI兩種病毒接種量，病毒滴度最高均為106 TCID50左右，但峰值出現(xiàn)時(shí)間和下降速度存在差異，0.01 MOI接種量出現(xiàn)峰值晚，但是維持高滴度時(shí)間較長(zhǎng)。本文成功分離一株小反芻獸疫病毒，并對(duì)兩種接毒量的生長(zhǎng)特性差異進(jìn)行了初步分析，為探索該病毒培養(yǎng)方法和收毒時(shí)間提供了借鑒。

小反芻獸疫病毒；病毒分離；病毒培養(yǎng)；TCID50；生長(zhǎng)曲線

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）又稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎綜合征等，是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，臨床以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為主要特征的綿羊和山羊的一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率最高可分別達(dá)到100%和90%[1，2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病，是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》重點(diǎn)防控的13種外來動(dòng)物疫病之一。該病于1942年在非洲西部的象牙海岸科特迪瓦首次暴發(fā)，2007年[3]和2013年先后傳入我國(guó)西藏和新疆部分地區(qū)，并在其他多地出現(xiàn)PPR疫情。

PPRV與牛瘟病毒（RPV），犬瘟熱病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV—K1）和人麻疹病毒（MV）等同為副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbolivirus）成員[4]?；蚪M為單股負(fù)鏈、無節(jié)段RNA[5]。其RNA鏈從3'到5'端依次為編碼N-P-M-F-H-L蛋白的基因[5]。目前該病毒僅有一個(gè)血清型，從遺傳演化上，根據(jù)F基因分析可分為四個(gè)族系，IV系主要分布在中東和西亞，我國(guó)發(fā)生的PPR疫情也為IV系[3，6]。

本研究將患病羊的組織病料接種VERO DS細(xì)胞，分離出一株P(guān)PRV，經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)確認(rèn)后，對(duì)0.1和0.01 MOI病毒接種量的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同接種劑量條件下，病毒具有不同的增殖曲線。本研究對(duì)于如何分離PPRV具有一定實(shí)踐意義，此外，還揭示了用VERO DS細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖時(shí)，接毒劑量與增殖、病毒活力之間的關(guān)系，為PPRV的培養(yǎng)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Hettich MIKRO 220R低溫臺(tái)式離心機(jī)；Olympus倒置熒光顯微鏡；Heraeus CO2培養(yǎng)箱；杭州博日Gene Max PCR儀；Count Star細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；DMEM購(gòu)自life公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；VERO DS細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；High pure viral RNA kit購(gòu)自ROCHE公司；PPRV特異性單克隆抗體和VERO DS細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；PPRV常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法為本實(shí)驗(yàn)室建立。

1.2 VERO DS細(xì)胞的準(zhǔn)備

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的VERO DS細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代，待細(xì)胞覆蓋細(xì)胞瓶底70%時(shí)，PBS洗2次，備用。

1.3 病料采集與處理

采集發(fā)病期間死亡羊的脾臟，充分剪碎后加入10倍量的Hank's液，研磨器中研磨成乳劑，以3 000 r/min離心沉淀10 min后取上清液，0.2 μm孔過濾除菌，備用。

1.4 病料接種

將處理好的病料上清液按培養(yǎng)液體積的1/10接種VERO DS細(xì)胞系，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附，1h后棄去上清，PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)未接病料對(duì)照，每天觀察細(xì)胞病變情況。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 RT-PCR檢測(cè) 細(xì)胞出現(xiàn)病變后，連續(xù)傳三代，取第三代病毒液200 μL，用ROCHE公司High pure viral RNA kit提取病毒RNA，并用PPRV特異性檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.5.2 免疫熒光檢測(cè) 將病毒接種于長(zhǎng)滿單層VERO DS細(xì)胞的96孔板，置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，待病變達(dá)60%～70%時(shí)，吸凈培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次，加入95%的甲醇固定10min。棄掉固定液，敞開培養(yǎng)板使其自然干燥。加0.5%Triton室溫作用15 min。用PBS將PPRV特異性單克隆抗體1:2 000稀釋后加入培養(yǎng)板，40 μL/孔，37℃振搖孵育1 h。PBST洗滌三次，每孔加入40μL 1:100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG，37℃振搖孵育1 h，PBST洗滌三次，加90%甘油50μL。熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.5.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 測(cè)定第三代病毒液TCID50，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞濃度，分別以0.01 MOI 和0.1 MOI[7]接種VERO DS 細(xì)胞各14瓶，每隔12h取出1瓶-70℃凍存，用于檢測(cè)病毒滴度，連續(xù)培養(yǎng)7天。分別測(cè)定14瓶細(xì)胞的TCID50，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與CPE觀察結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，接毒后第3天可見細(xì)胞發(fā)生融合，形成多個(gè)大小不等的合胞體（圖1）。第4天，病變細(xì)胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀，繼之出現(xiàn)大片脫落（圖2）。連續(xù)傳至第3代，每代可見相同的CPE。將該分離毒命名為PPRV-S。

2.2 病毒的RT-PCR鑒定

用PPRV特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在300bp左右出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符，將擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工測(cè)序，核酸片段為PPRV特異性核酸片段（圖3）。

2.3 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

間接免疫熒光檢測(cè)顯示，在接種PPRV-S分離毒的細(xì)胞孔發(fā)現(xiàn)綠色熒光，陰性對(duì)照孔未發(fā)現(xiàn)綠色熒光（圖4），表明該分離毒可被PPRV特異性單克隆抗體識(shí)別。

圖1 細(xì)胞融合形成合胞體

圖2 細(xì)胞病變脫落呈拉網(wǎng)狀

圖3 PPRV的RT-PCR鑒定結(jié)果

圖4 免疫熒光檢測(cè)（400×）

2.4 TCID50檢測(cè)結(jié)果

不同接毒時(shí)間TCID50的檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒接種細(xì)胞后病毒滴度首先出現(xiàn)一定程度下降，在12-24h病毒滴度最低，之后開始快速升高，36-60h達(dá)到峰值，兩種病毒接種量的最高TCID50為接近106TCID50/mL，之后緩慢下降。接毒168h后，病毒滴度仍能達(dá)到103-104TCID50/mL（圖5）。

不同病毒接種量TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示，0.1 MOI接種量在接種后36h即可達(dá)到病毒滴度峰值，0.01 MOI接種量則在60h病毒滴度峰值。就出現(xiàn)后的下降速度而言，0.1 MOI接種量出現(xiàn)峰值后滴度迅速下降，84h后病毒滴度降低至104TCID50/mL以下，而0.01 MOI接種量出現(xiàn)峰值雖然較晚，但直至接毒132 h后病毒滴度才下降至104TCID50/mL以下；兩者在接毒168h后，病毒滴度基本相同，為103.5TCID50/mL左右（圖5）。

圖5 PPRV-S的TCID50變化曲線

3 討論

PPRV是一種有囊膜的單股RNA病毒，在2007年首次傳入我國(guó)西藏，時(shí)隔6年又傳入我國(guó)新疆地區(qū)。據(jù)OIE網(wǎng)站提供資料，除新疆外，該病2014年在我國(guó)多個(gè)省、市、自治區(qū)相繼發(fā)生，防控形勢(shì)極為嚴(yán)峻。多角度研究PPRV相關(guān)特性，為PPR防控提供技術(shù)支持很有意義。

目前用于分離病毒的細(xì)胞為VERO細(xì)胞系和VERO DS細(xì)胞系。研究發(fā)現(xiàn)，病毒在感染細(xì)胞的過程中，SLAM蛋白是介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要受體，促使病毒囊膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，進(jìn)而使病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[8]。VERO DS細(xì)胞系因在細(xì)胞表面存在犬SLAM受體，提高了病毒的分離效率，因此理論上說，VERO DS細(xì)胞系比VERO細(xì)胞系更適合用于PPRV分離，但是由于羊和犬的SLAM蛋白同源性不到70%，所以VERO DS細(xì)胞系仍不是用于PPRV分離的最佳細(xì)胞。由于本實(shí)驗(yàn)室沒有細(xì)胞表面存在的羊SLAM蛋白的細(xì)胞系，所以用VERO DS細(xì)胞進(jìn)行PPRV分離。

由于PPRV對(duì)環(huán)境的抵抗力非常弱，50℃60分鐘即可被滅活，陽(yáng)光照射也容易將病毒滅活[7，9]?，F(xiàn)實(shí)工作中，從對(duì)發(fā)病羊采集樣品到運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離往往需要幾天甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這時(shí)的樣品雖然用RT-PCR仍能檢測(cè)出高含量的病毒核酸，但病毒往往已經(jīng)不具有感染性，不適合進(jìn)行病毒分離。因此，一旦確定采樣的目的是分離病毒，需要在采集樣品后及時(shí)冷凍保存并盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離，避免反復(fù)凍融和在室溫下放置太長(zhǎng)時(shí)間。此外，運(yùn)輸過程中也要保持低溫。同時(shí)，還需要盡量選擇病毒含量高的組織樣品用于病毒分離，以提高分離效率。但需要注意的是，由于腸組織中含有大量的酶類成份，容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，不太適合用于病毒分離。

本研究除分離到一株P(guān)PRV外，還繪制了分離毒的生長(zhǎng)曲線。通過對(duì)接毒后168h 的觀察發(fā)現(xiàn)，病毒接種后24h內(nèi)，病毒滴度出現(xiàn)下降，可能由于病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但還未產(chǎn)生具有感染性的新的病毒。24h至36h是病毒的對(duì)數(shù)繁殖期，這一時(shí)期有大量的新病毒被釋放出來，之后病毒滴度開始出現(xiàn)緩慢降低或維持一定水平。本文采用了兩個(gè)病毒接毒劑量，0.1MOI和0.01MOI，其中0.1MOI孔出現(xiàn)病毒滴度峰值的時(shí)間明顯早于0.01MOI組，但之后迅速下降。而0.01MOI組雖然出現(xiàn)峰值的時(shí)間明顯晚于0.1MOI組，但卻略高于0.1MOI組，而且能夠在較高的滴度維持較長(zhǎng)的時(shí)間。兩種接毒劑量在168h均有一定的感染力。這一研究對(duì)于PPR疫苗研究和生產(chǎn)過程中何時(shí)收獲病毒液有一定借鑒意義。由于目前我國(guó)使用的PPR疫苗為弱毒疫苗，因此如何保證生產(chǎn)過程中活毒效價(jià)非常重要?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)過程中無法對(duì)每個(gè)批次進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50測(cè)定，作者建議采用能使病毒在高滴度維持較長(zhǎng)時(shí)間的0.01MOI接種劑量。需要說明的是，本文只研究了PPRV在VERO DS細(xì)胞系上的生長(zhǎng)曲線，如果了解在VERO細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性，還需要另外進(jìn)行相關(guān)研究。

Isolation and Growth Characteristics Study of a Peste des Petits Ruminants Virus Isolate from Xinjiang

Zhang Yongqiang ，Wu Xiaodong ，Zou Yanli ，Bao Jingyue ，Wang Xiaozhen ，Wang Zhiliang
（National Research Center for Exotic Animal Diseases / China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong，266032）

The pathological samples containing high titer of peste des petits ruminants virus（PPRV）were chosen and treated to inoculate VERO DS cell line for PPRV isolation. The third passage cultures were used for PCR test and indirect immuno- fl uorescence test to make sure that peste des petits ruminants virus was isolated after CPE appearance in the cell line. In order to understand the virus growth characteristics，VERO DS cell was inoculated with the culture of 0.1 MOI and 0.01 MOI and cultivated for 168 hours and TCID50 was tested every 12 hours. The results showed that CPE appeared 72 hours after inoculation and PPRV was successfully isolated as identified by RT-PCR test and indirect immuno- fl uorescence test. The growth curve showed that the highest titer of the two inoculation doses reached nearly 106TCID50but with different shapes. The study is hoped to provide references in PPRV isolation and culttivation.

peste des petits ruminants virus；virus isolation；virus culture；TCID50；growth curve

S852.65+4

A

1005-944X（2015）10-0076-04

王志亮

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胡藕祥）