王 勇，南文龍，鞏明霞，張悅勇，3，彭大新，陳義平

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，診斷試劑研究室，山東青島 266032；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

布魯氏菌5種蛋白的原核表達(dá)及其作為間接ELISA檢測(cè)用抗原的適用性比較

王 勇1，2，南文龍1，鞏明霞1，張悅勇1，3，彭大新2，陳義平1

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，診斷試劑研究室，山東青島 266032；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

為比較布魯氏菌蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC作為間接ELISA檢測(cè)用抗原的適用性，本研究原核表達(dá)并純化了這5種蛋白，分別以其作為包被抗原，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了布魯氏菌病5種血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，重組蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC大小分別約為32 ku、21 ku、30 ku、51 ku和38 ku，均可被布魯氏菌陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)性。利用5種重組蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法，與牛結(jié)核、牛病毒性腹瀉等常見(jiàn)牛病陽(yáng)性血清之間無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)28份陰、陽(yáng)性參考血清進(jìn)行檢測(cè)，以BP26作為包被抗原建立的間接ELISA P/N值最高。利用建立的方法和IDEXX試劑盒對(duì)48份臨床血清樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，重組蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC相應(yīng)ELISA方法的符合率分別為87.5 %、87.5 %、89.6 %、85.4 %、79.2 %。結(jié)合敏感性、特異性等因素綜合分析，以重組蛋白BP26作為檢測(cè)抗原建立的間接ELISA方法效果較為理想，可適用于臨床布魯氏菌感染的檢測(cè)。

布魯氏菌；重組蛋白；間接ELISA；適用性

布魯氏菌?。ú疾。┦怯刹剪斒暇˙rucella）引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征的人畜共患傳染病[1]。近年來(lái)，我國(guó)人間和畜間布病感染率均呈現(xiàn)明顯回升態(tài)勢(shì)。

快速準(zhǔn)確檢測(cè)是防治布病的關(guān)鍵。目前，布病血清抗體檢測(cè)方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)、ELISA等[2]。其中，ELISA技術(shù)以其敏感性高且可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，在布病血清學(xué)檢測(cè)中具有推廣應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后應(yīng)用不同的重組蛋白（如BP26、OMP16、SP41、Virb8等）作為包被抗原，建立了檢測(cè)布病血清抗體的間接ELISA方法（iELISA），但檢測(cè)效果不盡相同[3-7]。本研究通過(guò)原核表達(dá)純化BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC 這5種布魯氏菌重組蛋白，并分別以其作為包被抗原建立iELISA方法，比較5種方法對(duì)布病血清抗體檢測(cè)的適用性。

1 材料和方法

1.1 菌株及血清

牛種布魯氏菌疫苗株A19（B. abortusA19）；牛結(jié)核陽(yáng)性血清、牛大腸桿菌陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉陽(yáng)性血清、?？谔阋哧?yáng)性血清；經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、IDEXX ELISA試劑盒3種方法檢測(cè)均為布病血清抗體陽(yáng)性的參考牛血清樣品20份，檢測(cè)均為陰性的參考牛血清樣品8份；近年來(lái)采集于我國(guó)部分布病疫區(qū)的臨床牛血清樣品48份。以上實(shí)驗(yàn)材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、pMD18-T克隆載體購(gòu)自大連寶生物公司；pET-28a（+）表達(dá)載體購(gòu)自Life公司；核酸及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自VWI公司；His-鎳柱親和純化試劑盒購(gòu)自Clontech公司；酶標(biāo)板購(gòu)自云鵬科技發(fā)展有限公司；山羊抗牛IgG-HRP購(gòu)自KPL公司；TMB購(gòu)自Biosynth公司；牛布魯氏菌病Pourquier? ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。

1.3 重組蛋白的制備及鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank中登錄的布魯氏菌基因組（序列號(hào)：NC-010742.1、NC-010740.1、CP009099.1）序列，利用Primer premier 5.0軟件對(duì)OMP16、BP26、CP39、SP41和eryC基因設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物兩側(cè)添加合適的酶切位點(diǎn)，引物由大連寶生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.2 目的片段的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取B.abortusA19 基因組DNA，以其為模板，應(yīng)用表1中的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將純化的PCR 產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體上，再經(jīng)酶切后連接pET-28a（+）表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-OMP16、pET-28a-BP26、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28a-eryC。提取重組表達(dá)質(zhì)粒，雙酶切鑒定正確后，由大連寶生物公司測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白表達(dá)與純化。將pET-28a-OMP16、pET-28a-BP26、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28a-eryC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以終濃度為1 mg/mL的IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，12 %SDS-PAGE凝膠電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。常規(guī)方法回收包涵體蛋白，并以His-鎳柱親和純化試劑盒純化重組蛋白，測(cè)定蛋白濃度，Western-blot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。

1.4 5種蛋白進(jìn)行間接ELISA的適用性比較

1.4.1 iELISA方法的建立。以純化的重組蛋白作為包被抗原，用0.05M pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液進(jìn)行倍比稀釋（濃度范圍8000 ng/mL～250 ng/mL），每孔加入100 μL，4℃包被過(guò)夜。同時(shí)，將陰性和陽(yáng)性血清樣品分別進(jìn)行50倍、100倍、200倍和400倍稀釋，山羊抗牛IgG-HRP酶標(biāo)二抗按1:5000稀釋，進(jìn)行方陣測(cè)定，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。然后，再對(duì)各反應(yīng)時(shí)間以及酶標(biāo)二抗工作濃度等條件分別進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)檢測(cè)已知背景的牛布病陰陽(yáng)血清樣品，確定iELISA方法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 交叉反應(yīng)檢測(cè)。分別利用5種重組蛋白建立的的iELISA方法，檢測(cè)牛結(jié)核陽(yáng)性血清、牛大腸桿菌陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉陽(yáng)性血清和?？谔阋哧?yáng)性血清。

1.4.3 參考血清樣品的檢測(cè)。分別用5種重組蛋白的iELISA方法檢測(cè)28份參考血清樣品，計(jì)算每種抗原檢測(cè)20份陽(yáng)性血清樣品OD450的平均值P和檢測(cè)8份陰性血清樣品OD450的平均值N，再計(jì)算P/N值。

1.4.4 臨床血清樣品檢測(cè)。分別用5種重組蛋白的iELISA方法檢測(cè)48份牛血清樣品，并用IDEXX公司的牛布魯氏菌病Pourquier? ELISA試劑盒平行檢測(cè)，分析比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

以B.abortusA19 基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC分別擴(kuò)增出約為868 bp、556 bp、732 bp、1392 bp、985 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組蛋白的表達(dá)及Western-blot 鑒定

含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BP26、pET-28a-OMP16、pET-28a-CP39、pET-28a-SP41、pET-28aeryC的BL21菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別表達(dá)了分子量大小約為32 ku、21 ku、30 ku、51 ku和38 ku的目的條帶，其大小與預(yù)期一致（圖2）。經(jīng)His-鎳柱親和純化后獲得純化的重組蛋白，將純化的重組蛋白與牛布魯氏菌陽(yáng)性血清反應(yīng)，結(jié)果顯示5種重組蛋白均可以被陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)性（圖2）。

圖2 重組蛋白的表達(dá)及western-blot鑒定結(jié)果

2.3 間接ELISA 反應(yīng)程序的確定

經(jīng)優(yōu)化，重組蛋白BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC的最佳包被濃度分別為0.5 μg/mL、4μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL 和 2 μg /mL，待檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1:100。具體ELISA反應(yīng)程序?yàn)椋阂詐H 9.6的碳酸鹽緩沖液將這5種重組蛋白分別稀釋至各自最佳包被濃度，每孔包被100μL，4 ℃包被過(guò)夜；PBST洗滌3 次，每孔加2 % BSA封閉液300μL，37℃封閉2 h；PBST洗滌3 次，每孔加1:100稀釋的待檢牛血清樣品及陰、陽(yáng)性對(duì)照血清 100μL，37℃孵育30 min；PBST洗滌3 次，每孔加1:40000稀釋的酶標(biāo)抗體（山羊抗牛IgG）100μL，37℃孵育 30 min；PBST洗滌 3 次，每孔加新配制的TMB顯色液100 μL，37 ℃孵育10 min ；最后，每孔加入 2 mol/L H2SO450 μL 終止反應(yīng)。計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照血清OD450平均值ODP、陰性對(duì)照血清OD450平均值ODN，檢測(cè)樣品OD450值為ODs。 判定標(biāo)準(zhǔn)：（ODs—ODN）/（ODP—ODN）≥0.6時(shí)， 判 為 陽(yáng) 性；（ODs—ODN）/（ODP—ODN）＜ 0.6時(shí)，判為陰性。

2.4 交叉反應(yīng)性檢測(cè)

利用5種重組蛋白建立的iELISA方法對(duì)牛結(jié)核陽(yáng)性血清、牛大腸桿菌陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉陽(yáng)性血清和?？谔阋哧?yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，5種布魯氏菌重組抗原與上述幾種常見(jiàn)牛病陽(yáng)性血清之間均無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 參考血清樣品檢測(cè)

分別用5種重組蛋白的iELISA方法檢測(cè)28份參考血清，結(jié)果顯示，20份陽(yáng)性參考血清檢測(cè)的陽(yáng)性平均值，BP26（0.415）、SP41（0.419）〉 CP39（0.36）、eryC（0.377）〉 OMP16（0.225）；8份陰性參考血清檢測(cè)的陰性平均值，BP26（0.115）、OMP16（0.123）＜ CP39（0.173）＜ SP41（0.205）、eryC（0.206）；P/N值，BP26（3.6）〉 CP39（2.08）、SP41（2.04）〉 OMP16（1.83）、eryC（1.83）。結(jié)果表明，以BP26重組蛋白建立的iELISA方法，檢測(cè)結(jié)果背景值最低且P/N值最高。

2.6 臨床血清樣品檢測(cè)

分別用5種重組蛋白的iELISA方法檢測(cè)48份牛血清樣品，并與IDEXX ELISA試劑盒平行檢測(cè)比較，結(jié)果顯示，其敏感性BP26（90.9 %）、OMP16（90.9%）、CP39（97 %）、SP41（90.1 %）和eryC（90.1 %）；特異性BP26（80 %）、OMP16（80 %）、CP39（73.3 %）、SP41（73.3 %）和eryC（53.3 %）；符合率BP26（87.5%）、OMP16（87.5 %）、CP39（89.6 %）、SP41（85.4 %）和eryC（79.2 %）。結(jié)果表明，針對(duì)本次檢測(cè)的48份牛血清樣品，這5種重組蛋白iELISA的敏感性均大于90 %，但特異性方面差別較大，BP26、OMP16的特異性優(yōu)于CP39、SP41，eryC的特異性低，僅為53.3 %。綜合分析敏感性、特異性、符合率結(jié)果，以BP26檢測(cè)效果較為理想。

3 討論

常用的布病血清學(xué)檢測(cè)方法中，虎紅平板凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性；試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜。與之相比，ELISA方法敏感、特異、易于標(biāo)準(zhǔn)化，并可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。目前，ELISA試劑盒大都是以脂多糖（LPS）作為包被抗原，LPS特異性抗體是布病血清檢測(cè)方法的主要檢測(cè)對(duì)象。但小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9等革蘭氏陰性菌與布魯氏菌在LPS O鏈（OPS）上存在相同的抗原表位，檢測(cè)時(shí)可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；此外，LPS的制備涉及到布魯氏菌培養(yǎng)，存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，高純度LPS的制備工藝也較為復(fù)雜。應(yīng)用布魯氏菌重組蛋白作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA，則可有效避免上述問(wèn)題。但應(yīng)用不同布魯氏菌重組蛋白作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)效果是有差異的，評(píng)價(jià)檢測(cè)效果時(shí)所采用的復(fù)核方法及樣品也不相同，獲得的評(píng)價(jià)指標(biāo)間難以有效地平行比較[3-7]。

本研究原核表達(dá)了BP26、OMP16、CP39、SP41、eryC 這5種布病檢測(cè)用重組蛋白，westernblot結(jié)果顯示這5種重組蛋白均可以被布病陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)性。之后，比較了這5種重組蛋白作為iELISA檢測(cè)抗原的適用性。這5種重組蛋白作為包被抗原的iELISA方法檢測(cè)時(shí)，與牛結(jié)核、牛病毒性腹瀉等常見(jiàn)牛病陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)布病參考血清樣品檢測(cè)時(shí)，以BP26檢測(cè)效果較好，一方面其包被濃度最低，另一方面P/N值顯著高于其他4種重組蛋白，檢測(cè)結(jié)果背景值更低且陰、陽(yáng)性結(jié)果的區(qū)分更好。結(jié)合臨床樣品檢測(cè)結(jié)果，綜合分析敏感性、特異性、符合率等因素，以BP26作為檢測(cè)抗原建立的間接ELISA方法效果較為理想，可適用于臨床布魯氏菌感染的檢測(cè)。

利用5種重組蛋白進(jìn)行iELISA平行檢測(cè)28份參考血清樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)同一血清樣品針對(duì)這幾種蛋白的反應(yīng)性并不完全一致，如一份陽(yáng)性血清針對(duì)某種蛋白所測(cè)定的OD450值是同組血清樣品的最高值，而針對(duì)另一種蛋白所測(cè)定的OD450值則低于該組樣品的陽(yáng)性平均值。表明在布病感染的不同時(shí)期或不同感染個(gè)體中，血清中針對(duì)不同布魯氏菌抗原的抗體含量存在差異。因此，在進(jìn)行臨床血清樣品檢測(cè)時(shí)，可選擇反應(yīng)譜更加寬泛的布魯氏菌抗原，或是篩選兩種及以上的重組蛋白混合包被，以獲得理想的檢測(cè)效果。

Prokaryotic Expression and Applicability Comparison of Five Brucella Proteins as Antigens in Indirect ELISAs

Wang Yong1，2，Nan Wenlong1，Gong Mingxia1，Zhang Yueyong1，3，Peng Daxin2，Chen Yiping1
（1. Laboratory of Diagnostics Development，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

In order to compare the applicability of different coating antigens in indirect-ELISA（iELISA）for detectingBrucellaantibodies，BP26，OMP16，CP39，SP41and eryC ofBrucellawere expressed with prokaryotic system，purified and used as coating antigens respectively in iELISA assays and their effects were compared. The results showed the expressed recombinant BP26，OMP16，CP39，SP41and eryC were about 38 ku，21ku，30ku，51ku and 38ku respectively，and all of them were recognized byBrucellapositive serum. All thefive iELISA assays had no cross-reactivity with bovine tuberculosis or bovine viral diarrhea sera. Detection of 28 reference serum samples showed that the iELISA with BP26 as coating antigen had the highest P/N value. A parallel detection of 48 clinical serum samples was carried out，and compared to the results of commercial kits（IDEXX），the agreements were 87.5 % for BP26-iELISA，87.5 % for OMP16-iELISA，89.6 % for CP39-iELISA，85.4 % for SP41-iELISA and 79.2 % for eryC-iELISA. In conclusion，the effect of BP26 used as antigen in iELISA was relatively ideal.

Brucella；recombinant proteins；indirect ELISA；applicability

S852.61+4

A

1005-944X（2015）10-0072-05

青島市科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)計(jì)劃（14-2-4-79-jch）

注：王 勇、南文龍為并列第一作者

陳義平

[1]丁家波，馮忠武. 動(dòng)物布魯氏菌病疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，2013，25（1）：91-99.

[2]劉志國(guó)，任清華，王秒，等. 布病特異性血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用概述[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（10）：1026-1031.

[3]Chaudhuri P，Prasad R，Kumar V，et al. Recombinant OMP28 antigen-based indirect ELISA for sero-diagnosis of bovine brucellosis[J]. Mol Cell Probes，2010，24（3）：142-145.

[4]Eoh H，Jeon BY，Kim Z，et al. Expression and validation of D-erythrulose 1-phosphate dehydrogenase fromBrucellaabortus：a diagnostic reagent for bovine brucellosis[J]. J Vet Diagn Invest，2010，22（4）：524-530.

[5]張輝，陳創(chuàng)夫，喬軍，等. 基于重組蛋白SP41的布魯氏菌間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（5）：624-628.

[6]左玉柱，王增利，路廣計(jì)，等. 牛布魯氏菌BP26 間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（3）：223-226.

[7]張劍，馬衛(wèi)明，張亮，等. 牛布魯氏菌毒力基因Virb8 間接ELISA 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（16）：3460-3469.

胡藕祥）