趙莎莎，潘 欣，趙玉勤，閆海強，楊最素

（浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江舟山 316022）

青蛤酶解多肽體外抗氧化活性的研究

趙莎莎，潘 欣，趙玉勤，閆海強，楊最素

（浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江舟山 316022）

以青蛤內臟為原料，應用堿性蛋白酶對其進行酶解，以DPPH清除率為指標，采用正交實驗確定堿性蛋白酶酶解的最佳條件，測定酶解多肽對DPPH清除率、超氧自由基清除率、螯合力和還原鐵的能力；使用瓊脂糖凝膠電泳檢測多肽對羥自由基誘導損傷的pBR322 DNA的保護作用，使用SDS-PAGE電泳測定青蛤多肽的分子量。結果表明青蛤內臟堿性蛋白酶酶解的最佳條件為溫度50℃、時間4 h、酶添加量2 000 μ/g、pH 9。得到的青蛤多肽在濃度為5 mg/mL時，DPPH的清除率為91.24%，羥自由基的清除率為62.83%，Fe2+的螯合力為61.13%，還原力為0.331。青蛤多肽對羥自由基誘導損傷的pBR322 DNA有一定的保護作用；該多肽的分子量范圍為15～25 kDa。因此青蛤內臟經堿性蛋白酶酶解得到的多肽具有較好的抗氧化活性。

青蛤；堿性蛋白酶；酶解多肽；抗氧化性

青蛤Cyclina sinensis(Gmelin)屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科，俗稱黑蛤、圓蛤、鐵蛤等，分布于我國沿海潮間帶的泥砂灘中，是我國沿海地區(qū)常見的一種貝類。青蛤肉質鮮美、營養(yǎng)豐富，除有較高的食用價值之外還是一種重要的海洋藥物?！渡褶r本草經》、《本草綱目》以及《本草綱目拾遺》均將青蛤作為一種常用藥物收錄在其中。近年來研究表明，青蛤肉提取物能增加老年大鼠脾中的淋巴細胞、巨噬細胞活性及淋巴結中的巨噬細胞活性，對提高細胞免疫應答及機體正常免疫力等有重要的作用[1]；粗青蛤多糖在體外具有抗氧化活性，對四氯化碳誘導的小鼠肝毒性模型具有重要的保護作用[2]。而有關青蛤酶解多肽的抗氧化活性實驗報道不多。本文以新鮮青蛤內臟為原料，利用酶解所得的水解液進行體外抗氧化實驗，并探討其對羥自由基誘導損傷pBR322 DNA的保護作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗原料及試劑

新鮮青蛤購于舟山南珍市場，去殼取內臟，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?；堿性蛋白酶購于北京亞太恒信生物科技有限公司；鄰二氮菲、DPPH、鐵氰化鉀購自上海晶純試劑有限公司；其余試劑為分析純均購置國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

BSA1245型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；CF16RX高速冷凍離心機（日立公司）；UV-1600PC型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SSW型微電腦電熱恒溫水槽（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；DYCZ-28C型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 酶解工藝

考慮1（溫度）、2（時間）、3（酶活添加量）、4（pH）四個因素，每個因素選三個水平進行正交實驗，比較堿性蛋白酶在不同水解條件下的DPPH自由基清除率，從而確定堿性蛋白酶的最佳水解條件（表1）。酶解液的制備工藝是：青蛤肉臟用勻漿機破碎，按1∶3比例加入蒸餾水，用一定濃度的鹽酸和氫氧化鈉溶液調節(jié)勻漿液的pH值，加入堿性蛋白酶進行酶解，實驗結束后用沸水滅活10 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min，取上清液旋轉蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，測定DPPH自由基清除率。

表1 堿性蛋白酶因素與水平Tab.1 Factors and levels of Alcalase

2.2 對DPPH自由基的清除作用

按照文獻[3]進行DPPH自由基清除活性測定。DPPH濃度0.1 mmol/L（無水乙醇溶解）避光保存，方法是1 mL樣品+1 mLDPPH，混勻后，避光保存30 min，4 000 r/min離心10 min，517 nm處測吸光度Ai。同時測1 mL無水乙醇+1 mL樣品混合的測吸光度Aj，與1 mL DPPH+1 mL水混合測吸光度Ac。計算公式為

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

2.3 對羥自由基清除率的測定

[4]所述方法，并做適當調整。取0.75mmol/L鄰二氮菲1mL于試管中，依次加入pH值為7.4的PBS2mL，樣品液1mL，振蕩混勻后加濃度為0.75 mol/L的硫酸亞鐵1mL，充分混勻，再加入0.03%雙氧水1mL，37℃水浴1 h，在536 nm處測其吸光度As；空白組用水代替雙氧水，為Ab；損傷組用水代替樣品，為Ap。

清除率（%）=[（As-Ap）/(Ab-Ap)]×100%

2.4 對Fe2+離子的螯合作用

實驗方法參照文獻[5]，在干凈的具塞試管中依次加入不同質量濃度的受試樣品(1～5 mg/mL)0.5 mL，20 μM FeCl2溶液1 mL，混勻后加入0.5 mM ferrozine 1 mL，25℃反應20 min后于562 nm處測定吸光度Ab；空白組以水代替樣品，為Ac。

螯合力（%）=（1-Ab/Ac）×100%

2.5 還原能力的測定

參照文獻[6]方法并略有改動。將干凈的具塞試管中分別依次加入樣品1 mL，另加入1 mL Tris-HCl（0.2 mol/L，pH為6.6）及1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻后于50℃水浴20 min，然后加入10%三氯乙酸1.5 mL，混勻后3 000 r/min離心10 min。準確移取上清液2.0 mL，加入蒸餾水2.0 mL以及0.1%三氯化鐵0.5 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定吸光度值A，吸光度值越大表明還原力越強。

2.6 對羥自由基誘導損傷的pBR322 DNA保護作用

采用文獻[7]的實驗方法評價青蛤多肽對羥基自由基誘導的DNA損傷的保護作用。將0.5 μL的pBR322 DNA溶解在3 μL濃度為50 mmol/L的PBS液中，并轉移到微量離心管中，同時加入2 mmol/L新鮮配制的FeSO4溶液3 μL和不同濃度的青蛤多肽溶液2 μL，再加入4 μL質量分數30%的H2O2溶液，混合物在37°C下反應30 min后，加入DNA上樣緩沖液（熒光）結束反應?？瞻捉M僅為pBR322DNA和上樣緩沖液，各組點樣于1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓條件下電泳70 min。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果，并拍攝照片。

2.7 SDS-PAGE分析多肽的電泳行為

用15%的分離膠、5%的濃縮膠灌制SDS-PAGE凝膠。將15%的分離膠加入電泳玻璃板中并用水把分離膠表面壓平，20 min后將水倒掉，灌入5%的濃縮膠。上樣量為0.01 mL，接通電源電壓調至90 V，待樣品進入分離膠后調至130 V。待樣品到達距離分離膠底部0.5 cm時關閉電源，取出凝膠在染色液中染色1 h，最后脫色4 h，拍照。

3 結果與分析

3.1 正交實驗結果

本實驗以DPPH清除率為指標，進行四因素三水平L9（34）的正交實驗，結果見表2。由表2中可知，影響堿性蛋白酶水解多肽DPPH清除率的各因素排列順序為D＞A＞C＞B，即pH值影響最大，水解時間影響最小。因此堿性蛋白酶水解青蛤獲得多肽的最佳水解條件為A3B1C3D1。選擇的溫度為50℃、時間4 h、酶活添加量量2 000 u/g、pH 9作為最佳水解條件。

表2 堿性蛋白酶酶解青蛤內臟正交實驗結果Tab.2 Results of L16(45)orthogonal test of Alcalas aboutC.sineensis'sentrails

3.2 酶解多肽對DPPH自由基的清除率

將最佳酶解條件下得到的水解物冷凍干燥，檢測質量濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL時的水解物對DPPH自由基的清除率。結果如圖1所示，青蛤堿性蛋白酶水解物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增大。當濃度為5 mg/mL時，清除率達到91.24%；當青蛤多肽對DPPH的清除能力達50%時，所需的多肽質量濃度為1.57 mg/mL。

圖1 青蛤酶解多肽對DPPH自由基清除率Fig.1 DPPHradical scavenging activities ofC.sinensispeptides

3.3 酶解多肽對羥自由基清除率

樣品濃度設置同3.2，檢測其對羥自由基的清除率，結果如圖2所示。不同濃度的堿性蛋白酶水解物對羥自由基均有一定程度的清除作用，并且隨著濃度升高，清除率增大，但酶解多肽對羥自由基的清除率低于DPPH，當濃度為5 mg/mL時，清除率為62.83%。當青蛤酶解多肽對羥自由基的清除率達50%時，所需的多肽質量濃度為2.1 mg/mL。

圖2 青蛤酶解多肽對羥自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activities ofC.sinensispeptides

3.4 酶解多肽對Fe2+的螯合作用

樣品濃度設置同3.2，檢測酶解多肽對Fe2+離子的螯合作用，結果如圖3所示。隨著水解物濃度的升高，螯合力增大，當濃度為5 mg/mL時，螯合力為61.13%。Fe2+的螯合能力的EC50為 2.75 mg/mL。

圖3 青蛤酶解多肽對Fe2+離子的螯合作用Fig.3 TheFe2+chelationofC.sinensispeptides

3.5 酶解多肽的還原能力

樣品濃度設置同3.2，分別檢測其還原力。根據還原力的測定方法，在700 nm處的吸光度越大，水解物的還原能力越強。從圖4可知，在所設置的濃度范圍內，隨著濃度增大，還原力增強，即呈現濃度依賴性。

圖4 青蛤酶解多肽的還原力Fig.4 ThereducingpowersofC.sinensispeptides

3.6 酶解多肽對羥自由基誘導損傷pBR322 DNA的保護作用

當DNA暴露在羥自由基中時被裂解成三種形式—超螺旋結構（supercoil DNA，SC-DNA）、開環(huán)結構（open cycle DNA，OC-DNA）和線性結構形式。開環(huán)結構代表單鏈DNA斷裂，線性結構表示雙鏈斷裂[8]。青蛤酶解多肽對羥自由基誘導的DNA氧化損傷的保護作用如圖5所示。從圖中可以看出，未被羥自由基損傷的原質粒pBR322DNA（Blank）幾乎全部呈超螺旋結構的DNA，而對照組（control）即加入Fe2+和H2O2反應后，DNA幾乎全部呈開環(huán)狀態(tài)，表明羥自由基對pBR322DNA有損傷作用。但加入青蛤酶解多肽后，超螺旋結構的DNA逐漸增多，而開環(huán)結構的DNA逐漸減少，并且隨著樣品濃度逐漸增加，以超螺旋形式存在的DNA明顯增多。而凝膠上并未出現線性條帶，這可能是該實驗中產生的羥自由基作用程度不足以使質粒DNA雙鏈斷裂[9]。這些結果表明，該多肽能顯著地抑制羥自由基誘導的DNA氧化損傷，可能與該多肽可以阻止Fe2+和H2O2反應，并通過提供氫原子和電子而直接清除羥自由基，進而保護質粒DNA不被損傷有關[10]。

圖5 青蛤多肽抗羥自由基誘導pBR322DNA損傷能力的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 The agarose gel electrophoresis ofC. sinensispeptides to hydroxyl radical-induced pBR322 DNA breaks

3.7 青蛤多肽分子量的測定

青蛤多肽分子量的測定如圖6所示，酶解物組分經SDS-PAGE電泳，染色、脫色后顯示為單一條帶，且條帶分子量在15～25 kDa之間顯示。

圖6 青蛤酶解多肽的SDSPAGE電泳圖Fig.6 The SDS-PAGE gels ofC.sinensispeptides

4 結論

本實驗采用正交實驗探討堿性蛋白酶對青蛤進行酶解時各因素及水平對抗氧化活性的影響，結果顯示，水解物抗氧化活性最大的影響因素為pH值，最小的影響因素為水解時間，且當溫度為50℃、時間為4 h、加酶量為2 000 μ/g、pH為9時，水解多肽的DPPH清除率最大。在最佳抗氧化水解條件下得到的多肽，對羥自由基、DPPH自由基均有一定的清除活性，具有較好的Fe2+離子螯合力和還原性，且對羥自由基誘導損傷的pBR322 DNA具有保護作用，該多肽的分子量在15～25 kDa之間。下步將進一步對該多肽進行分離純化，并進行動物體內實驗，有望開發(fā)為抗氧化保健食品。

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Study on the Antioxidant Activity and its Characteristic of Cyclina sinensis in Vitro

ZHAO Sha-sha,PAN Xin,ZHAO Yu-Qin,et al

(School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products,Zhoushan 316022,China)

In this study,Cyclina sinensisviscera were used to study its antioxidant activity and characteristic. The orthogonal experiment was adopted to determine the optimal hydrolysis conditions ofC.sinensispolypeptide which effected by alkaline protease,and the ability of hydrolysates on DPPH free radical scavenging was determined,as well as the ability of scavenging superoxide free radical,chelating ability and the ability of reducing iron.The protective effect of the peptides against hydroxyl-radical-induced DNA damage was measured by DNA agarose electrophoresis and the molecular weight was detected by SDS-PAGE.The results showed that the optimum conditions of alkaline protease for hydrolysis were as follows∶temperature 50 oC,hydrolysis time 4 h,E/S 2000 U/g protein and Ph 9.0.As theC.sinensispolypeptide was 5 mg/mL,the rate of DPPH free radical scavenging was 91.24%,and that of the scavenging superoxide free radical,the ability of reduced iron were 62.83% and 61.13%,and the reducing power was 0.331.So,the polypeptide had a protective effect against DNA damageinduced by hydroxyl radical.And,it’s molecular weight was 15-25 kDa.The polypeptide isolated fromC.sinensisexhibited an obvious capability of anti oxidation.

Cyclina sinensis;alkaline protease;polypeptide;anti oxidation

R282.77

A

1008－830X(2015)01－0045－05

2014-07-10

浙江省自然科學基金項目（LY12C20005）

趙莎莎（1990-），女，山東惠民人，碩士研究生，研究方向：海洋功能食品.E-mail:zhaoshasha1216@126.com

楊最素（1967-），女，浙江定海人，副教授，研究方向：海洋功能食品.E-mail:yangzs87@163.com