鄭王山，程 簫，趙生國(guó)

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

作為NRAMP 基因家族的一員，NRAMP1（天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白）在小鼠中首次發(fā)現(xiàn)，然后在其他物種如人類、雞、牛和綿羊中被分離、測(cè)序并定位。小鼠對(duì)感染病原微生物抵抗性或易感性是通過(guò)在1號(hào)染色體顯性基因控制，稱為卡介苗、Ity 或LSH，因此這種控制基因被命名為NRAMP（天然抗性相關(guān)NRAMP1巨噬細(xì)胞蛋白）。NRAMP1編碼一種膜內(nèi)在蛋白，與原核和真核細(xì)胞運(yùn)輸結(jié)構(gòu)具有同源性，表明巨噬細(xì)胞膜特異性轉(zhuǎn)運(yùn)功能。最近的研究表明，NRAMP1 編碼一種具有運(yùn)輸和離子通道功能的糖蛋白。豬NRAMP1 基因位于15號(hào)染色體上的q23-26，和人類與小鼠的基因相似，豬NRAMP1基因全長(zhǎng)15kb，包含15個(gè)外顯子和14內(nèi)含子，其cDNA 長(zhǎng)1617bp，編碼538 個(gè)氨基酸?；蛑饕谔囟ǖ募?xì)胞內(nèi)表達(dá)，如巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和外周血細(xì)胞，編碼100kDa的的多肽，包含10～12個(gè)跨膜區(qū)，一個(gè)糖基化的細(xì)胞外肽鏈以和一個(gè)具有運(yùn)輸功能的結(jié)構(gòu)域，它可參與吞噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)活動(dòng)。

藏豬長(zhǎng)期生活在低氧、低溫度、高輻射、高海拔的獨(dú)特生境中，并且在很長(zhǎng)一段時(shí)間缺乏人力保障。在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中，在行為、生理和形態(tài)等方面形成許多獨(dú)特之處，以適應(yīng)獨(dú)特的生境。藏豬有比其他豬種更好的抗病能力。我們推測(cè)，藏豬NRAMP1基因可能與其有關(guān)。因此，筆者決定在五類豬中克隆NRAMP1 基因，并期望找到基因在五種豬之間的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

五種豬是藏香豬、甘肅黑豬、大白豬、約克夏豬、杜洛克。樣品均來(lái)自甘肅省。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)豬NRAMP1（U55068）基因在Genebank中公布的mRNA 序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)NRAMP1基因引物，詳見表1。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

PCR 反應(yīng)總體系：25μL，其中預(yù)混酶12.5μL、上下游引物各1μL、模板DNA1μL，加雙蒸水9.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃5min，94℃30s，72℃40s，72 ℃30s，72 ℃5min，將PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 NRAMP1基因引物參數(shù)

1.4 擴(kuò)增片段的序列分析

將PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒（Takara）純化，然后克隆到PMD-19T 載體，連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞中。含有陽(yáng)性克隆產(chǎn)物的質(zhì)粒用藍(lán)白斑篩選、提取、PCR鑒定并由上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。擴(kuò)增片段的序列用MEGA5軟件對(duì)齊。

1.5 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析

利用MB軟件對(duì)NRAMP1 基因進(jìn)行分析，分析其限制性內(nèi)切位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬NRAMP1基因的分子克隆

擴(kuò)增克隆到PMD-19T 載體的NRAMP1 基因并且測(cè)序。利用MEGA5 軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行比對(duì)。NRAMP1基因堿基A、G、T、C 的含量分別是23%、28%、27%、22% 。DNA 測(cè)序結(jié)果表明NRAMP1 基因序列全長(zhǎng)是12779bp，包括1 bp至570bp的5＇非編碼區(qū)和12459bp至12779bp的3＇非編碼區(qū)域，豬NRAMP1基因含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，如圖1所示。

圖1 NRAMP1基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 NRAMP1基因序列分析

五種豬之間的DNA 序列比較發(fā)現(xiàn)，這五種豬NRAMP1基因存在少數(shù)核苷酸突變。14個(gè)內(nèi)含子有11個(gè)核苷酸的突變，5＇端非編碼區(qū)有2個(gè)核苷酸突變，3＇非編碼區(qū)有10個(gè)堿基的突變和一個(gè)堿基缺失，這些核苷酸的突變無(wú)法導(dǎo)致氨基酸的改變。15個(gè)外顯子有18 個(gè)核苷酸突變，但有14個(gè)突變并沒(méi)有造成氨基酸的變化，僅有4個(gè)有義突變，其分別位于外 顯 子4（T2551G 和 A2552T）、外 顯 子5（C4881A）和外顯子14（T12113C），分別導(dǎo)致四個(gè)氨基酸（100（V→G）、137（P→T）、471（L→P））的改變。NRAMP1變異多態(tài)性序列如表2所示。

表2 NRAMP1的變異多態(tài)性序列

2.3 限制性位點(diǎn)分

豬NRAMP1基因有100個(gè)限制性位點(diǎn)，包含22個(gè)獨(dú)特限制性位點(diǎn)（AccBSI AflII AspA2IAsuNHI AvaIII AvrII BseX3IBspLU11IBspTI BsrBI Bst98I BstZI EagI EclXI Eco32I Eco52I EcoRI EcoRV EcoT22IEge I EheI Zsp2I），42個(gè)非特異性限制位點(diǎn)（AatII AccIII Acc16IAclI Aor13HI AssI AsuII AviII BanIII Bsa29IBseCI BsiWI Bsp13IBsp68IBsp106I Bsp119I Bsp1407I BspCI BspDI BspEI BspT104I BspXI BsrGI BssHI Bst1107IBstAUI BstBI BstSNI BstZ17IBsu15IBsuTUI BtrI ClaI Csp45IEco105IZrmI），如圖2所示：

圖2 藏豬限制性位點(diǎn)示意圖

3 討論

盡管細(xì)胞對(duì)病原體所造成的感染性疾病的抵抗機(jī)制存在大量信號(hào)，但是這些信號(hào)和機(jī)制是未知的，也許其中NRAMP1 具有最重要的作用。作為NRAMP1基因家族的成員，NRAMP1基因是最早在近交系小鼠中公認(rèn)的抗沙門氏菌（鼠傷寒沙門氏菌［卡介苗］）和牛結(jié)核分枝桿菌的基因（結(jié)核桿菌鮑里斯［Ity］）。使用基因敲除的方法敲除NRAMP1基因，小鼠失去了抵抗結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌和利什曼原蟲能力。但是對(duì)藏豬NRAMP1的存在或功能的研究很少，所以筆者克隆了藏豬和其他四種豬的NRAMP1基因的全序，分析五種豬NRAMP1基因的序列和長(zhǎng)度并且采用分析生物信息學(xué)的方法分析五種豬NRAMP1基因結(jié)構(gòu)。

與相關(guān)報(bào)道人、小鼠、豬NRAMP1基因序列一致，豬NRAMP1基因的開放閱讀框?yàn)?614bp，編碼538 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。本研究克隆了NRAMP1基因的全序，全長(zhǎng)12779bp，5＇非編碼區(qū)域由1個(gè)bp至570bp，3＇非編碼區(qū)從12459bp至12779bp，具有15個(gè)外顯子，被14個(gè)內(nèi)含子隔開。藏豬NRAMP1基因外顯子大小與文獻(xiàn)報(bào)道的大白豬和雜種豬基本相符。對(duì)XiaolinDing等人對(duì)評(píng)估NRAMP1 基因?qū)ωi的免疫能力的影響進(jìn)行了評(píng)估，表明NRAMP1 可視為生豬養(yǎng)殖過(guò)程中抗病力性狀分子標(biāo)記。應(yīng)三成開展藏豬NRAMP1基因表達(dá)的研究，表明藏豬的NRAMP1 基因比其他豬種表達(dá)組織更廣泛，藏豬可能是研究NRAMP1 基因?qū)膊〉挚剐院透腥拘缘恼滟F基因資源庫(kù)。而目前NRAMP1基因的研究多數(shù)在第六內(nèi)含子的多態(tài)性和誘發(fā)該基因表達(dá)的機(jī)理其與抗病性的關(guān)系。李娟娟等人對(duì)合作藏豬第六內(nèi)含子多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)突變位點(diǎn)。劉艷冬等人利用PCR- RFLP方法對(duì)貴州幾個(gè)地方豬種的NRAMP1基因第6內(nèi)含子NdeI酶切位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，基因型頻率在各豬種中的分布趨近一致，品種間無(wú)明顯差異。本研究在第六內(nèi)含子未發(fā)現(xiàn)變異，這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的樣本量和測(cè)序的準(zhǔn)確性有關(guān)，將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究。

本研究還分析了NRAMP1基因的限制性內(nèi)切位點(diǎn)，為該基因的載體構(gòu)建和表達(dá)以及在生物工程上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。Samantha Gruenheid 等人研究認(rèn)為NRAMP1控制細(xì)胞內(nèi)寄生蟲或微生物吞噬體的環(huán)境，從而達(dá)到抵抗病原微生物的目的。GuoLong Zhang 等對(duì)豬NRAMP1基因mRNA 表達(dá)的細(xì)胞和組織特異性最高在巨噬細(xì)胞并且是通過(guò)激活MAPK 通路誘導(dǎo)NRAMP1 基因表達(dá)。本研究則是克隆NRAMP1 該基因的全序，分析其基因變異位點(diǎn)、數(shù)量和核苷酸突變后導(dǎo)致氨基酸變化來(lái)推測(cè)這幾種豬在抗病性上表現(xiàn)出的差異，本研究發(fā)現(xiàn)4個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)致氨基酸的變化，外顯子4（T2551G 和A2552T）有兩種突變，導(dǎo)致在100位密碼子處單個(gè)氨基酸改變（V→G）。剩下的2個(gè)突變?cè)谕怙@子5（C4881A）和外顯子14和（T12113C），導(dǎo)致改變137密碼子單個(gè)氨基酸（P→T）和471密碼子（L→P）。纈氨酸和脯氨酸這兩種疏水性氨基酸改變?yōu)橛H水性的甘氨酸和蘇氨酸。筆者預(yù)測(cè)由于氨基酸的性質(zhì)改變可能引起蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)或更高級(jí)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)排布變化，從而使藏豬與其他豬種之間產(chǎn)生了對(duì)病原微生物抵抗力存在差異的原因。不過(guò)，引起豬的抗病性的因子很多，是由基因和生境共同決定的，所以藏豬NRAMP1 基因與其抗病力之間的關(guān)系以及NRAMP1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還需要在今后工作中進(jìn)一步關(guān)注學(xué)習(xí)研究。

4 結(jié)論

本研究擴(kuò)增NRAMP1 基因的全序，利用克隆和測(cè)序的方法分析了的結(jié)構(gòu)、突變位點(diǎn)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)等，為更深入了解基因與動(dòng)物疾病控制關(guān)系以及有效識(shí)別和控制，也為揭示NRAMP1 基因抗病性分子機(jī)理和其他物種NRAMP1基因的研究奠定了理論基礎(chǔ)并提供科學(xué)借鑒。

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