葉海瓊，傅曉冬

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州 646000)

論著·臨床研究

妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤小動脈平滑肌大電導(dǎo)鈣激活鉀通道表達(dá)水平的定量測定*

葉海瓊，傅曉冬△

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州 646000)

目的觀察妊娠期高血壓疾病(HDCP)孕婦胎盤小動脈中大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的蛋白表達(dá)，探討B(tài)KCa在該疾病發(fā)生機(jī)制中的作用。方法取HDCP孕婦(HDCP組，=15)與健康孕婦(NT組，n=15)胎盤小動脈平滑肌，用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測BKCa通道α亞基及β1亞基的蛋白水平。結(jié)果胎盤小動脈平滑肌檢測顯示，BKCa通道α亞基在NT組的蛋白相對表達(dá)量為1.028 2±0.180 6，HDCP組為1.001 2±0.169 8，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；β1亞基在NT組的蛋白相對表達(dá)量為1.616 8±0.012 6，HDCP組為0.418 1±0.080 8，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HDCP胎盤小動脈平滑肌BKCa通道α亞基蛋白表達(dá)無明顯變化，β1亞基蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。由此推測大電導(dǎo)鈣激活鉀通道可能參與了HDCP的發(fā)生、發(fā)展，β1亞基的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致HDCP血管舒縮功能障礙的一個重要基礎(chǔ)。

妊娠期高血壓疾?。淮箅妼?dǎo)鈣激活鉀通道；α亞基；β1亞基

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel,BKCa)廣泛分布于全身如平滑肌、骨骼肌、神經(jīng)元、腎臟等多種組織中，在血管平滑肌中的表達(dá)尤為豐富，在血管平滑肌靜息電位的維持及血管張力的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，是血管緊張性的決定因素之一[1]。BKCa通道由α亞基和β1基構(gòu)成，α亞基是BKCa通道的基本結(jié)構(gòu)單位，β亞基有4種亞型β1～β4，其中β1亞基是最先被證實(shí)的BKCa通道相關(guān)蛋白[2]。妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是極度威脅孕婦健康的一種妊娠特有性疾病，有逐年發(fā)展的趨勢，其基本病理生理變化是全身小動脈痙攣，是一種血管性疾病[3]，因此推測大電導(dǎo)鈣激活鉀通道可能與HDCP有著不容忽視的聯(lián)系。本研究通過Western blot手段檢測健康孕婦和HDCP胎盤小動脈平滑肌細(xì)胞上大電導(dǎo)鈣激活鉀通道中α亞基和β1亞基的蛋白相對表達(dá)量，從分子水平探討B(tài)KCa通道與該疾病的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HDCP組:確診為HDCP并終止妊娠的孕婦15例，平均血壓(166.50±17.13/95.80±11.16)mm Hg，平均年齡(23.7±2.8)歲；NT組:同期終止妊娠的健康孕婦15例，平均血壓(121.17±8.24)mm Hg/(78.27±8.07)mm Hg，平均年齡(22.6±2.5)歲。HDCP組診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》。

1.2 儀器與試劑 α亞基抗體及β1亞基抗體(美國novus公司)，HRP羊抗兔二抗及HRP羊抗鼠二抗(碧云天公司)。采用的實(shí)驗(yàn)儀器主要有:凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，水平和垂直電泳系統(tǒng)(美國GE公司)，轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，濾紙、硝酸纖維素膜(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 選取的病例終止妊娠時，當(dāng)胎盤娩出后立即取含小動脈的胎盤組織塊約2 cm×2 cm×2 cm，置于4 ℃ PPS中轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室。將胎盤組織塊在顯微鏡下選擇小動脈，將仔細(xì)輕柔分離出的血管迅速放入液氮，然后轉(zhuǎn)入-70 ℃超低溫冰箱凍存。

1.3.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 首先配制濃度為8%的分離膠、5%的濃縮膠。液氮冷凍條件下將組織搗碎成粉末，加入蛋白裂解液，分離提取蛋白，加熱使蛋白充分變性。隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉，一抗孵育(稀釋BKCa α及BKCa β1為1∶1 000，β-actin為1∶2 000)和二抗孵育(羊抗兔1∶4 000，羊抗鼠1∶2 000)后加發(fā)光試劑反應(yīng)，所得條帶用于實(shí)驗(yàn)分析。

2 結(jié) 果

2.1 胎盤小動脈平滑肌中BKCa通道α亞基的蛋白表達(dá) 在正常孕婦及妊娠期高血壓孕婦的胎盤小動脈平滑肌上均有α亞基蛋白表達(dá)。在HDCP組α亞基蛋白的相對表達(dá)量為1.001 2±0.169 8，在NT組為1.028 2±0.180 6，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

A:Western blot檢測；B:柱狀圖。

圖1 兩組BKCa通道α亞基蛋白水平變化圖

2.2 胎盤小動脈平滑肌中BKCa通道β1亞基的蛋白表達(dá) 在正常孕婦及妊娠期高血壓孕婦的胎盤小動脈平滑肌上均有β1亞基蛋白的表達(dá)。HDCP組β1亞基蛋白的相對表達(dá)量為0.418 1±0.080 8，NT組為1.616 8±0.126 6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A:Western blot檢測；B:柱狀圖。

圖2 兩組BKCa通道β1亞基蛋白水平變化圖

3 討 論

HDCP是一種妊娠期特有的威脅全球孕產(chǎn)婦健康的復(fù)雜性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制至今未明。該疾病被部分學(xué)者認(rèn)為是孕婦的一種血管性疾病，血管舒縮分子調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致血管通透性增高，從而引起全身多個器官的血管痙攣導(dǎo)致孕婦血壓升高、相應(yīng)器官的缺血缺氧及機(jī)體代謝的紊亂。例如，機(jī)體正常狀態(tài)下，調(diào)控血管舒縮的細(xì)胞因子保持動態(tài)平衡，控制機(jī)體的血壓與局部血流。HDCP時，引起血管舒張的重要生理因子一氧化氮(NO)的產(chǎn)生與釋放功能受到抑制[4]，從而導(dǎo)致血管收縮與舒張因子比例失衡，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血壓升高。有研究認(rèn)為，NO產(chǎn)生的減少是影響該疾病病理生理變化的關(guān)鍵因素，其舒張血管的作用則主要是通過激活BKCa通道來實(shí)現(xiàn)的。NO可通過GC-cGMP-PKG途徑使BKCa通道開放，該途徑通過磷酸化方式激活從而引起血管平滑肌細(xì)胞膜超極化，血管平滑肌肌肉松弛，血管擴(kuò)張，血壓下降[5]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮素1(ET-1)、前列環(huán)素(PGI2)、血管緊張素-2(Ang-2)等都可能與BKCa通道的活性有關(guān)，而這些血管活性因子與HDCP關(guān)系密切[6]。因此，當(dāng)HDCP發(fā)生時，全身血管平滑肌尤其小血管平滑肌上的BKCa通道可能表達(dá)異常，進(jìn)而使血管舒縮功能失衡引起血壓異常，筆者推測，作為BKCa通道重要組成部分的α亞基與β1亞基也可能會異常表達(dá)，因此本研究運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測出HDCP孕婦胎盤小動脈平滑肌的β1亞基蛋白表達(dá)明顯降低，而α亞基并沒有改變。這提示作為血管平滑肌細(xì)胞興奮的重要調(diào)節(jié)因素，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的功能與β1亞基密切相關(guān)，與α亞基關(guān)系并不密切。

大量研究已表明，BKCa通道在血管平滑肌中高表達(dá)，攜帶了70%～80%的外向電流，4個相同的α亞基是其主要結(jié)構(gòu)單位[7]。但大鼠實(shí)驗(yàn)時，高血壓組大鼠BKCa通道β1亞基均下調(diào)，而α亞基并沒有變化[8]。Brenner等[9]進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)時敲除了小鼠β1亞基所編碼的KCNMB1基因，小鼠出現(xiàn)了血管收縮、血壓升高。Amberg等[10]觀察到在自發(fā)性高血壓大鼠腦動脈血管平滑肌細(xì)胞中BKCa通道β1亞基有所減少及通道中鈣離子的敏感性有所降低，同時他們應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析自發(fā)性高血壓大鼠腦動脈BKCa通道β1亞基的mRNA比正常血壓大鼠表達(dá)降低,而α亞基的mRNA表達(dá)無改變，上述結(jié)果均與筆者實(shí)驗(yàn)相吻合。由此，筆者大膽推測HDCP時血管平滑肌細(xì)胞上BKCa通道功能異常主要是由起調(diào)節(jié)作用的β1亞基的表達(dá)量多少來決定，β1亞基的異?？赡苁菍?dǎo)致HDCP血管功能障礙的一個重要基礎(chǔ)，α亞基雖為通道主要結(jié)構(gòu)，但在高血壓疾病中的作用顯得微乎其微。

大量證據(jù)證明，BKCa通道在血管平滑肌細(xì)胞中的功能障礙與人類高血壓息息相關(guān)[11]，HDCP是一種特殊時期特殊類型的高血壓也與BKCa通道關(guān)系密切。BKCa通道β1亞基在HDCP及正常血壓狀態(tài)下均發(fā)揮著不容忽視的作用，但其具體作用機(jī)制及反饋調(diào)節(jié)均有待進(jìn)一步研究。

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The quantitative determination of BKCa channels in placental arteriole smooth muscle cells of hypertensive disorder complicating pregnancy*

YeHaiqiong,FuXiaodong△

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the change of protein levels of large conductance calcium activated potassium channel (BKCa) in placental arteriole smooth muscle cells from hypertensive disorder complicating pregnancy and discuss its role.MethodsWestern blot analysis was used to examine protein expression of α subunit and β1subunit of BKCa channels in placental arteriole smooth muscle cells from hypertensive disorder complicating pregnancy.ResultsThe relative protein expression level of α-subunit in the HDCP group was 1.001 2±0.169 8(n=15),and the NT group was 1.028 2±0.180 6 (n=15).There was no significant differences between the two groups (P>0.05);the relative protein expression level of β1subunit in the HDCP group was 0.418 1±0.080 8 (n=15),and the NT group was 1.616 8±0.012 6 (n=15),the β1-subunit protein expression levels of HDCP group were significantly lower (P<0.05).ConclusionThe protein expression of β1-subunit,but not α-subunit,was reduced in placental arteriole smooth muscle cells from hypertensive disorder complicating pregnancy.Therefore,BKCa channel activity may have been involved in hypertensive disorder complicating pregnancy;and the abnormal expression of β1subunit maybe an important basis in hypertensive disorder complicating pregnancy.

hypertensive disorder complicating pregnancy;large-conductance calcium activated potassium channels;α-subunit;β1-subunit

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.019

四川省科技廳項(xiàng)目(2012SZ0178)。

:葉海瓊(1980-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

,Tel:13679692523;E-mail:dongerfu@163.com。

R714.252

A

1671-8348(2015)30-4229-03

2015-03-12

2015-06-16)